[發明專利]犢牛凝乳酶的制備方法

無效

• 申請號: 02115260.8
• 申請日: 2002-05-23
• 公開（公告）號: CN1379090A
• 公開（公告）日: 2002-11-13
• 發明（設計）人: 陳燕娜
• 申請（專利權）人: 陳燕娜
• 主分類號: C12N9/48
• 分類號: C12N9/48;C07K1/36
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及凝乳酶的制備，尤其涉及犢牛凝乳酶的制備方法。

凝乳酶存在于動物、植物和微生物體內，其作用是使牛乳凝固。國外有關凝乳酶的報道甚多，而且有液體、膠狀、粉劑和片劑等多種形式的凝乳酶商品。但我國目前所用的凝乳酶制劑，主要源于進口，應用于乳品中的凝乳酶的生產還是一項空白。

凝乳酶按其來源可分為動物凝乳酶、植物凝乳醇和微生物凝乳酶。動物凝乳酶是干酪生產中應用最早的一類酶，不論在風味、質地和產量方面都優于其它來源的凝乳酶。微生物和植物來源的凝乳酶蛋白水解性較差，能把K-酪蛋白水解成較小的多肽片段，而且在成熟過程中易產生苦味，限制了它們在生產中的應用。

動物來源的凝乳酶主要存在于犢牛和羔羊的胃蛋白里。1960年，美國為提取凝乳酶宰殺了800萬頭犢牛。我國幅員遼闊，并不匱乏犢牛和羔羊資源。用于制作血清、制藥或肉用屠宰的犢牛胃，作為副產品進行廢物利用，目前可收集應用的犢牛有1.8-2.5萬頭，而且仍在增加。

傳統的犢牛凝乳酶的提取是將屠宰后的犢牛皺胃洗凈，置于陰涼通風處，風干干燥，然后用粉碎機粉成粉末，粉末即為提取出來的粗酶。傳統犢牛凝乳酶的提取方法不但提取時間長，而且在風干過程中酶很容易失活，活力回收率不高，酶含量低。

本發明的目的就在于尋找出一種簡便易行、省時經濟、酶含量及活力回收高的犢牛凝乳酶的制備方法。

本發明將新鮮或冷凍的犢牛皺胃清洗后用奶粉和CaCl₂抹于表面，經低溫條件下誘導后，剔除膠原、脂肪，切碎，稱重，加入預冷4℃的提取液，提取液內含有5％NaCl和10％無水乙醇的水溶液，提取液的容積與物料濕重比為3-5∶1；然后勻漿，攪拌浸提30-240min，離心后取上清液；殘渣再加入預冷4℃的含有5％NaCl和10％無水乙醇的水溶液提取液，提取液的容積與物料濕重比為1-3∶1；然后勻漿，攪拌浸提180-240min，離心后取上清液；合并兩次所得的上清液，于上清液中加入容積數為上清液5％的1mol/L的HCl，沉淀雜蛋白，離心，取上清液，于上清液中加入重量數為上清液5％的NaCl，溶解出酶蛋白；用1mol/L的NaOH調整pH值為微酸性后，即為液體粗酶。

將液體粗酶用DEAE離子交換柱層析，0.05mol/L-0.4mol/L、pH5.4-6.4檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液進行pH線性梯度洗脫，洗脫液的流速為1.25ml/min，收集器收集洗脫液，每管裝5ml，洗脫至洗脫液在280nm波長下無吸收，洗脫液在280nm波長下出現6個蛋白峰，收集的第12-16管為峰I、21-25管為峰II、30-34管為峰III。實驗證明：其中峰I、峰II、峰III與酶活性峰重疊，其余的是沒有酶活性的蛋白液，而峰I的酶活性最高。取峰I酶液，經透析、聚乙二醇濃縮到原體積的1/3后，再用Sephadex層析柱層析，0.05mol/L-0.4mol/L、pH5.4-6.4檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液進行pH線性梯度洗脫，洗脫液的流速為5ml/min，收集器收集洗脫液，每管裝5ml，洗脫至洗脫液在280nm波長下無吸收，洗脫液在280nm波長下出現3個蛋白峰，其中峰III與酶活性峰重疊，所收集的第19-26管的蛋白液便是純化的凝乳酶，其余的是不具有酶活性的蛋白液。純化的凝乳酶，其比活力為171.43U/mg蛋白，蛋白濃度為0.007mg/ml。其主要的酶學性質如下：凝乳酶的反應最適的溫度為55℃，當溫度低于25℃時，凝乳很慢，從30℃開始，隨著溫度的升高，活力也隨之增大，但高于55℃時，活力迅速下降；凝乳酶在40℃處理90min，酶活力很穩定，但隨著溫度的升高，酶的活力發生變化，在55℃處理90min，有36.7％的活力喪失；凝乳酶作用的最適pH值為5.8，在pH值5.8以下和以上，酶的活力都有所下降，在pH3.0-6.0之間是穩定的；原料乳干物質含量小于8％時，30min內不凝固，從9％開始，隨干物質的增加，其活力也增高；Ca²⁺濃度在0.025-0.125％范圍內，隨加入量的增加，凝乳酶的活力也增加，Ca²⁺濃度在0.125％以上，酶活力增加緩慢。

本發明優點：一.提取方法簡便易行、省時經濟、酶含量及活力回收高。二.原料來源容易、價廉，適應產品的綜合開發利用。三.工藝生產設備投資少，工藝簡單易行，為我國凝乳酶的開發利用和新型乳制品市場開拓提供新的途徑。