[發明專利]胚胎造血干、祖細胞懸液及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 02112661.5
• 申請日: 2002-02-09
• 公開（公告）號: CN1364874A
• 公開（公告）日: 2002-08-21
• 發明（設計）人: 黃斌;黃寧;黃裕權;付中苓;潘欣;彭蕾;孫俊
• 申請（專利權）人: 黃斌;黃寧;黃裕權
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08;A61K35/12;A61K35/28;A61K35/14;A61B17/00;C12Q1/02
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技術領域

本發明胚胎造血干、祖細胞懸液及其制備方法和應用，涉及的是利用現代生物技術分離提取制備胚胎優質超劑量造血干、祖細胞及其方法，它可應用于臨床造血干、祖細胞移植，治療相關的血液病、遺傳病腫瘤以及放化療引起的免疫功能損傷等的一種生物制品。

背景技術

臨床造血干、祖細胞移植，起始于成體骨髓移植。由外科手術從供者骨髓中抽取骨髓，這對供者造成的創傷是一般人難以承受的，加之，成體骨髓中的造血干、祖細胞抗原表達充分，分化、分裂處于后期(卵黃囊-胎肝-脾-胎骨髓-成骨髓)，相比較而言，造血干、祖細胞的質量較差，CD34⁺CD38^-在CD34⁺細胞中的相對含量較低。隨著科技的進步和發展，發現臍血中的造血干、祖細胞也可用于臨床造血干、祖細胞的移植，它與成骨髓中的造血干、祖細胞相比，其發育、分化較早，抗原表達較弱，CD34⁺CD38^-在CD34⁺細胞中的相對含量比成骨髓中的高，HLA配型要求比成骨髓低，但同一份臍血中的相對造血干、祖細胞總數較少，很難滿足成人造血干、祖細胞移植數量的需要，因此在臨床應用中有很大的局限性。不同臍血混合使用，數量雖能增加，但因基因型、血型、HLA抗原組合的不同，其質量大受影響，很難在臨床上廣泛使用。在體外培養條件下，通過干細胞生長因子的刺激使造血干、祖細胞擴增，雖能使細胞擴增數十倍至數萬倍，但無一例能在體內重建長期造血功能。現已發現，現有技術擴增的僅是祖細胞而不是干細胞。所以目前體外擴增仍處在研究階段，還不能用于臨床。為了增加造血干、祖細胞的數量，借助于休外造血干、祖細胞擴增的技術，將造血干細胞生長因子注射體內，促使體內骨髓造血干、祖細胞分裂擴增再從外周血中分離提取造血干、祖細胞，雖能獲得大量造血干祖細胞，但質量沒有臍血造血干、祖細胞的質量高，此外外周血成熟的T細胞含量較多，移植物抗宿主病(GVHD)發生率高且程度較重。從胚胎的胎肝中提取干、祖細胞應用于臨床，在20世紀80至年代國內外學者分別作出嘗試，他們都是從16-22周的胎兒胎肝中獲取造血干、祖細胞用于臨床細胞移植，但是此時期中的造血干、祖細胞相對總數較少，很難滿足超劑量的數量要求；此外由于發育屏障，異基因胎肝中的造血干、祖細胞很難在受體骨髓中歸巢，因為微環境差異較大，所以成功率較低。

發明內容

本發明目的，針對上述不足之處提供一種優質超計量胚胎造血干、祖細胞懸液及其制備方法和應用.本研究發現的一種22周以上胚胎中的優質超劑量造血干、祖細胞，它能替代上述的成骨髓造血干、祖細胞，成體外周血中的干、祖細胞，臍血中的造血干、祖細胞和16-22周胎肝中的造血干、祖細胞。并可用于臨床造血干、祖細胞移植。

胚胎發育的早期，胎骨髓尚無造血功能，在胚胎發育過程中逐漸形成造血功能，并逐漸增強最終代替肝臟造血，胎齡在22周前胎骨髓造血干、祖細胞的相對總數較少，其臨床意義不大，22周后隨著胎齡的增加，胎骨髓中造血干、祖細胞相對總數和胎肝中的造血干、祖細胞數都相應的增加。脾臟相對于肝臟而言重量較輕，體積較小，造血干、祖細胞相對總數較少，可分離提取，亦可忽略不記。

胚胎造血干、祖細胞懸液是由胎齡為22周以上的胎骨髓造血干、祖細胞懸液和胎肝造血干、祖細胞懸液兩部分構成。

胚胎造血干、祖細胞制備方法：

將孕婦水囊引產自愿捐贈并經公證的死胎娩出后，置于0°-10℃保存；1-16h內送至實驗室；在無菌條件下先從胎心中抗凝抽取胎血標本，供血型和HLA抗原檢測，然后分別解剖取出相關胎骨(股、肱、脛、腓、橈、尺等骨)、胎肝，置于培養液中，0-10℃保存。

A、胎骨髓造血干、祖細胞懸液的制備：

(1)用骨鉗、骨剪和解剖刀剪將胎骨去骨膜和兩端的軟骨；

(2)用吸有抗凝劑的培養液注射器，將針頭分別插入兩端的骨疏松質中，加壓將骨髓沖至收集瓶中；

(3)用骨剪從長骨的中段剪斷，并將注射器針頭插至骨髓腔中反向加壓沖洗，直至骨質中的骨髓細胞基本沖出為止，沖洗培養液約為20-80ml，視其胎齡大小而定；

(4)將收集瓶中的骨髓細胞懸液，經300-500目篩網過濾；

(5)計量骨髓細胞懸液原液；

(6)取上述適量骨髓細胞原液，經紅細胞裂解在顯微鏡下統計有核細胞相對總數；

(7)經苔酚藍染色統計死活細胞比例；