[發明專利]胚胎造血干、祖細胞懸液及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 02112661.5
• 申請日: 2002-02-09
• 公開（公告）號: CN1364874A
• 公開（公告）日: 2002-08-21
• 發明（設計）人: 黃斌;黃寧;黃裕權;付中苓;潘欣;彭蕾;孫俊
• 申請（專利權）人: 黃斌;黃寧;黃裕權
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08;A61K35/12;A61K35/28;A61K35/14;A61B17/00;C12Q1/02
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1、一種胚胎造血干、祖細胞懸液，其特征是一種胎齡為22周以上含有優質超劑量的胚胎造血干、祖細胞，胚胎造血干、祖細胞懸液包括胎骨髓造血干、祖細胞懸液和胎肝造血干、祖細胞懸液。

2、一種胚胎造血干、祖細胞懸液的制備方法，其特征是將胎齡在22周以上經水囊引產的死胎娩出后置于0-10℃保存，1-16h內送至實驗室，在無菌條件和10-20℃室溫中，先從胎心中抗凝抽取胎血樣本供血型和HLA抗原檢測，然后分別解剖取出相關胎骨、胎肝、置于培養液中，0-10℃保存。

A、胎骨髓造血干、祖細胞懸液的分離和制備：

(1)用骨鉗、骨剪和解剖刀剪將胎骨去骨膜和兩端的軟骨；

(2)用吸有抗凝劑的培養液注射器，將針頭分別插入兩端的骨疏松質中，加壓將骨髓沖至收集瓶中；

(3)用骨剪從長骨的中段剪斷，并將注射器針頭插至骨髓腔中反向加壓沖洗，直至骨質中的骨髓細胞基本沖出為止，沖洗培養液約為20-80ml，視其胎齡大小而定；

(4)將收集瓶中的骨髓細胞懸液，經300-500目篩網過濾；

(5)計量骨髓細胞懸液原液；

(6)取適量骨髓細胞原液，經紅細胞裂解，在顯微鏡下統計有核細胞相對總數；

(7)經苔酚藍染色統計死活細胞比例；

(8)將等量淋巴細胞分離液置于試管下層，等量胎骨髓細胞原液置于淋巴細胞分離液上層；

(9)將上述試管置離心機中進行密度梯度離心；

(10)將試管中界面層的單個核細胞(MNC)吸至另一試管中，力求吸盡；

(11)向試管中加培養液稀釋吹吸混勻；

(12)經1000-1500r/15-10min離心棄上清液收集細胞；

(13)吹散細胞并加培養液稀釋混勻重復上述過程洗滌2-3次；

(14)將全部細胞收集于一個試管中制成濃縮的單個核細胞懸液；

(15)取上述適量懸液經梯度稀釋和紅細胞裂解，計算單個核細胞總數和死細胞百分率；

(16)取適量單個核細胞懸液置于培養液中0-10℃保存，作CD34⁺CD38⁺和CD34⁺CD38^-抗原檢測；

(17)取適量細胞懸液作生物污染檢測；

(18)其余細胞根據臨床需要取出所需數量的細胞懸液置于細胞培養液中供臨床造血干、祖細胞移植；

(19)剩余細胞懸液與適當濃度細胞凍存液混勻，裝入冷凍管中；

(20)以每分鐘下降2-3℃的速率將凍存管的細胞最終置于液氮中保存，為了避免造血干、祖細胞在制備MNC懸液過程中的丟失，胎骨髓細胞懸液，可將紅細胞裂解后直接供臨床細胞移植使用或液氮保存。

B、胎肝造血干、祖細胞懸液的分離和制備：

(1)用解剖剪鉗去除胎肝系膜組織和膽囊及大血管；

(2)將胎肝置于200-300目不銹鋼濾網上，用機械解離法通過邊擠壓邊加培養液沖冼，將解離過濾的細胞收集在燒杯中，胎肝和稀釋沖冼培養液重量之比要適當；

(3)將解離過濾的細胞懸液再經300-500目不銹鋼過濾網過濾；

(4)將上述細胞懸液按等量淋巴細胞分離液置于試管下層，等量上述胎肝細胞懸液小心輕放置于淋巴細胞分離液上層；

(5)將上述試管置于離心機中進行密度梯度離心；

(6)將經密度梯度離心試管中的單個核細胞層中的細胞吸移至另一試管里混勻；

(7)向試管中加培養液稀釋吹吸混勻；

(8)經1000-1500r/15-10min離心，棄上清液，收集細胞制成懸液，并向試管中加培養液稀釋離心洗滌2-3次；

(9)將全部細胞收集于一個試管中計算體積，制成濃縮的單個核細胞懸液；

(10)取適量上述細胞懸液經梯度稀釋和紅細胞裂解計算單個核細胞總數和死細胞百分率；

(11)取適量MNC置于培養液中0-10℃保存，作CD34⁺CD38⁺和CD34⁺CD38^-抗原檢測；

(12)取適量細胞懸液作生物污染檢測；

(13)其余細胞以適當濃度與細胞凍存液混勻，裝入冷凍管中；

(14)以每分鐘下降2-3℃的速率將凍存管的細胞最終置于液氮中保存。

3、根據權利要求1和2所述的胚胎造血干、祖細胞懸液在制備臨床造血干、祖細胞移植，治療相關的血液病、遺傳病、腫瘤以及放化療引起的免疫功能損傷生物制品中的應用。