[發(fā)明專利]含有攜帶剪接受體的基因工程細(xì)胞非編碼序列的高效逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 01802669.9
• 申請日: 2001-09-08
• 公開（公告）號: CN1388829A
• 公開（公告）日: 2003-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金善榮;柳承信;李準(zhǔn)臺
• 申請（專利權(quán)）人: 百療醫(yī)株式會社
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63
• 代理公司: 中科專利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 李悅

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于基因治療的高效安全的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它來源于鼠白血病病毒(MLV)，含有一個突變的異源剪接受體并且無MLV編碼序列。

發(fā)明背景

來源于鼠白血病病毒(MLV)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已經(jīng)應(yīng)用于50％以上被批準(zhǔn)的臨床基因治療試驗中(Wiley-The?Journal?of?Gene?Medicine?Website；http：//www.wiley.co.uk/genetherapy)。然而，妨礙這些載體更廣泛應(yīng)用的一個主要限制因素是基因表達(dá)水平?jīng)]有高到足以表現(xiàn)明顯的治療效果。本發(fā)明人以前曾構(gòu)建了不含病毒編碼序列但攜帶一個來自細(xì)胞或其它病毒基因的異源剪接受體序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(KR專利申請公開號(Laid-OpenPublication?No.)2000-6334)。這些載體之一含有一個來自人EF1α基因的剪接受體。該載體的基因表達(dá)水平明顯高于缺乏該剪接受體序列的對照載體。然而該載體存在的一個問題是病毒滴度隨著使用的包裝株系而改變。例如，當(dāng)使用基于NIH3T3的PG13株系時，病毒滴度降低約10倍。在來源于HI1080細(xì)胞的FLYA13中，病毒滴度降低3倍。RNA分析結(jié)果表明，低病毒滴度是由于含有包裝信號序列的基因組尺寸轉(zhuǎn)錄物的高效剪接。

本發(fā)明涉及對這種逆轉(zhuǎn)錄病毒的進(jìn)一步改進(jìn)，即在剪接受體的周圍的區(qū)域中導(dǎo)入突變。導(dǎo)入這些突變使逆轉(zhuǎn)錄病毒載體產(chǎn)生接近于對照水平的病毒滴度，而同時仍產(chǎn)生很高水平的基因表達(dá)。因此，該載體應(yīng)當(dāng)比在逆轉(zhuǎn)錄病毒基因治療中應(yīng)用的其它載體要有效的多。

發(fā)明概述

本發(fā)明的目的在于提供一種安全和高效的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其避免了RCR產(chǎn)生的風(fēng)險，而仍然能夠有效地表達(dá)可用于基因治療的外源基因。

按照本發(fā)明的這一方面，來源于鼠白血病病毒(MLV)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括：

1)一種插入多克隆位點上游的、作為來源于外源基因的非編碼序列的延伸因子EF1α的非編碼序列的區(qū)域，和

2)一種導(dǎo)入EF1α非編碼序列中的剪接受體的下游的突變。

附圖簡述

從下面結(jié)合附圖的本發(fā)明的說明中，本發(fā)明的上述，和其它目的和特征將變得更加清楚；這些附圖分別是：

圖1：載體MT1，2，3，4和5的序列，分別具有一種導(dǎo)入非編碼序列中的突變，該非編碼序列含有一個插入載體pMIN-EI中的人EF1α基因的內(nèi)含子和外顯子2的區(qū)域，

圖2：制備MT1的方法；

圖3：制備MT2的方法；

圖4：制備MT3的方法；

圖5：制備野生型MT4的方法；

圖6：制備MT5的方法；

圖7：制備含熒光素酶(Luc)基因的載體的方法；

圖8：IRES基因克隆的方法；

圖9：制備具有作為可篩選的標(biāo)記的MDR基因的MTM載體的方法；

圖10：制備載體MTM4和MTM5的方法，它們各自具有一個MDR基因作為可篩選的標(biāo)記；和一個修飾的EF1α非編碼序列。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供一種基于MLV(鼠白血病病毒)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其沒有任何病毒編碼序列，但的確包括一部分插入到多克隆位點的上游的延伸因子EF1α的非編碼序列，以便提供一個剪接受體，以及一種導(dǎo)入EF1α的非編碼序列中的剪接受體下游的突變。

在本發(fā)明中，“非編碼序列”指含有一種可以被轉(zhuǎn)錄但不能被翻譯的內(nèi)含子和外顯子區(qū)域的基因組區(qū)域。

特別地說，在本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中的EF1α的非編碼序列來源于人細(xì)胞。它含有一部分內(nèi)含子和外顯子2序列，優(yōu)選地，剛好在外顯子2的翻譯起始密碼子的前面的序列，更具體地說，是SEQ?ID?NO.1的核苷酸序列，其對應(yīng)人EF1α基因的3’末端到剛好在外顯子2的翻譯起始密碼子前面的部分(如果EF1α基因的轉(zhuǎn)錄起始密碼子的位點定為+1，那么它對應(yīng)于+773到+1006的序列)。

本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體還具有一個導(dǎo)入來源于外源基因的非編碼序列中的突變，以便在基因表達(dá)、剪接、和翻譯效率之間達(dá)到最優(yōu)化的平衡。