[發明專利]酶法快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽

無效

• 申請號: 01802073.9
• 申請日: 2001-06-20
• 公開（公告）號: CN1392901A
• 公開（公告）日: 2003-01-22
• 發明（設計）人: 樸英美;崔恩美;崔真熙;金性勛;白先熙;李上燮
• 申請（專利權）人: 樸英美
• 主分類號: C12Q1/26
• 分類號: C12Q1/26
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 丁業平,王維玉

發明背景

發明領域

本發明涉及一種用于快速定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽(γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸)的方法，更特定地涉及一種方法，通過將GSH誘捕劑處理樣品的步驟引入到采用氧化劑和谷胱甘肽還原酶的常規酶法分析谷胱甘肽中，可同時定量測定氧化型和還原型谷胱甘肽(GSSG·GSH)。

發明背景

谷胱甘肽為一種低分子量的巰基化合物，大部分以游離形式存在于細胞中，但也有部分形式與半胱氨酸和輔酶A以二硫鍵結合。谷胱甘肽依賴細胞的氧化/還原態以還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(或谷胱甘肽二硫化物，GSSG)的形式存在。正常情況下大部分胞內游離谷胱甘肽以還原型形式(GSH)存在，同時氧化型形式水平極低。例如，已知真核細胞中的GSH占到胞質中低分子量巰基化合物總量的80％以及線粒體中低分子量巰基化合物的10-15％。

盡管正常生理條件下產生的活性氧物質(ROS)持續氧化谷胱甘肽，但還原型谷胱甘肽由使用了胞內谷胱甘肽還原酶和NADPH的胞內抗氧化防御系統在體內維持了恒定分布。在正常的好氧微生物中，ROS作用受到細胞抗氧化防御系統的控制，即當細胞由于ROS變成氧化態時，ROS將GSH氧化成GSSG，因而細胞中GSH水平下降，然后正常細胞分泌GSSG到細胞外以維持GSH/GSSG比率恒定。然而，多種因素如輻射、疾病或藥物所引發的過量生成ROS導致了氧化性應力、ROS和抗氧化防御系統嚴重不平衡，這又反過來導致疾病狀態如發炎、免疫損傷、局部缺血、藥物和毒素誘導的反應以及衰老。因此，細胞抗氧化系統是細胞內維持穩態重要控制機理之一。

由于細胞中谷胱甘肽狀態反映了細胞的還原/氧化狀態，因此測定還原型和氧化型谷胱甘肽將指示細胞還原/氧化狀態。為使谷胱甘肽用作細胞還原/氧化狀態的指數，不僅谷胱甘肽總量重要，而且GSH/GSSG比率即氧化程度也同樣重要，因此必須準確定量測定GSH和GSSG。

定量測定谷胱甘肽的方法劃分為色譜法、酶法和化學法，即使用HPLC(高效液相色譜)法、采用分光光度計分析酶活性方法以及使用已知與谷胱甘肽特異性反應的鄰苯二醛(OPT)法(參見：Sies，H.，生物樣品中谷胱甘肽、谷胱甘肽二硫化物和谷胱甘肽混合二硫化物的分析，Methods?Enzymol.，77：373-383，1981；Tietze，酶法定量測定納克量的總谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽：哺乳動物血和其它組織中的應用，Anal.Biochem.，27：502-522，1969；Mokrasch，l.C.和Teschike，E.J.，培養細胞和嚙齒動物腦區域的谷胱甘肽含量：一種特異性的熒光測定法，Anal.Biochem.，140：506-509，1984)。

使用HPLC的色譜法為一種定量測定方法，采用光吸收物質或熒光物質處理含谷胱甘肽的樣品，然后測定由HPLC分離的物質的熒光或吸光度，它能檢測谷胱甘肽10-9摩爾的較低水平，但也有一些缺點如每個HPLC分析循環耗時超過30分鐘，一個樣品需要兩次HPLC循環分析來單獨測定GSH和GSSG，因此該法費時而且不適用分析大批量樣品。

酶法為另一種定量測定方法，包括使用氧化劑如DTNB(5，5′-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸))和谷胱甘肽還原酶的方法、乙二醛酶法即測定由乙二醛酶I催化GSH和甲基乙二醛間反應所產生的乳酰谷胱甘肽以及使用GSH轉移酶生產氯代二硝基苯和GSH混合物的方法。酶法具有樣品分析快速的優點(僅幾分鐘)。然而在一些意義上證明這些方法不令人滿意，如處理樣品困難，為偶爾需要的一些反應步驟費力準備許多試劑，各種試劑僅能在每次樣品分析時加入分析前混合，對溫度和環境條件敏感的酶和試劑每隔一些時間應重新制備。

另一個用于定量測定谷胱甘肽相對簡單的方法是熒光法，在沒有其它巰基化合物情況下其應用了OPT與GSH或GSSG形成熒光復合體的特性。使用OPT的熒光法簡單而且可用于分析大批量樣品，但是也暴露出由于胞內存在其它含硫化合物和氨基酸抑制了OPT與GSH或GSSG的反應從而導致特異性降低，以及不適用于組織樣品，因為使用OPT測定經NEM(N-乙基馬來酰亞胺)處理的樣品中的GSSG是在高pH條件下進行的。近來將如前所述的方法應用到多孔板中的方法也不合適。

在這些狀況下，強烈需要探索和開發可同時定量測定GSH和GSSG的簡便而準確的方法。

發明概述