[發明專利]重組葡激酶(126)的制備方法

無效

• 申請號: 01144248.4
• 申請日: 2001-12-14
• 公開（公告）號: CN1394952A
• 公開（公告）日: 2003-02-05
• 發明（設計）人: 趙玉山;崔維初;苗得足;李廣
• 申請（專利權）人: 山東瑞陽制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21
• 代理公司: 淄博科信專利代理有限公司
• 代理人: 馬俊榮

1、一種重組葡激酶(126)的制備方法，其特征在于以纖溶活性高的金黃色葡萄球菌為PCR擴增模板，將擴增出的葡激酶(126)基因片段插入pBV220載體質粒，轉化大腸桿菌，構建成重組葡激酶工程菌株。

2、根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于擴增模板的篩選方法為：

取得金黃色葡萄球菌，接種于LB的液體培養基中，振蕩過夜，離心、取上清，用于血纖維蛋白平板測定，似有溶解圈的，選其中纖溶活性最高的一株用作PCR擴增模板。

3、根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于葡激酶(126)基因擴增方法為：

取金黃色葡萄球菌單菌落，接種于LB液體試管培養基中，振蕩過夜，離心、收集菌體，加入緩沖液，懸浮，煮沸，室溫下離心分離，上清直接用作PCR反應。

4、根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于反應所用引物為：

上游引物為：5′CACGAATTCATGAAGGGCGATGACGCGAGT

下游引物為：5′CACGGATCCTATTTCTTTTCAATAACAAC.

5、根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于擴增反應步驟控制為：

???????92℃?????????60秒

???????50℃?????????50秒

???????72℃?????????50秒

30個循環，然后72℃延伸12分鐘。

6、根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于葡激酶(126)基因的構建與鑒定方法為：

將PCR擴增出的葡激酶(126)基因片段插入pUC19載體質粒，轉化大腸桿菌，涂于平板上，培養過夜；取白色菌落，接入LB的液體培養基中，培養過夜，提取質粒，用內切酶雙酶解后，以瓊脂糖凝膠電泳檢查，構建成重組葡激酶工程菌株(pUC-SaK126)。

7、根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于葡激酶(126)表達質粒的構建方法為：

將pUC-SaK126質粒雙酶解，以相同酶解的原核表達載體pBV220重組，轉化大腸桿菌DH5α，涂于LB-AmP平板，培養過夜；提取質粒，酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢查，含Sak126基因特征片斷者，為表達質粒pBVS126。

8、根據權利要求9所述的制備方法，其特征在于葡激酶(126)的分離純化方法為：

細胞破碎，提取粗酶，超濾截流后，進行疏水層析得產品。