[發(fā)明專利]可在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性復(fù)制并擴(kuò)散的重組腺病毒載體

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 01131218.1
• 申請(qǐng)日: 2001-09-03
• 公開（公告）號(hào): CN1335398A
• 公開（公告）日: 2002-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梁旻
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海三維生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/861
• 分類號(hào): C12N15/861;A61K48/00;A61K39/235;A61P35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及基因治療及病毒治療領(lǐng)域，具體的涉及到利用E1a基因促進(jìn)一種特殊的重組腺病毒載體(Ad.IR)特異性的在腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制與擴(kuò)散。

發(fā)明背景：

惡性腫瘤的基因治療，要求病毒載體可以高效的特異性的進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，表達(dá)治療性基因，或特異性的在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，進(jìn)而殺死腫瘤細(xì)胞。

目前作為基因治療的常見載體有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺病毒載體和腺相關(guān)病毒載體，其中作為腫瘤基因治療較為常用的是腺病毒載體。

腺病毒是一種雙鏈DNA病毒，其基因組長度約為36kb，分為早期轉(zhuǎn)錄區(qū)和晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)。目前發(fā)現(xiàn)，人腺病毒有47個(gè)血清型，分屬A-F6個(gè)亞屬，其中C亞屬的5型腺病毒是目前人們研究最為詳細(xì)的一種。

將腺病毒刪除E1區(qū)及E3區(qū)所得到的腺病毒載體常被稱為第一代腺病毒載體，這種載體可插入并表達(dá)長度為8kb以內(nèi)的外源基因，這種腺病毒載體本身不能復(fù)制產(chǎn)生子代病毒，腺病毒載體DNA也不整合入宿主細(xì)胞的基因組中。

腺病毒載體可感染多種類型細(xì)胞，包括靜止期細(xì)胞。腺病毒載體可以較容易的大規(guī)模培養(yǎng)并獲得高滴度的病毒純品。這些特點(diǎn)使得腺病毒作為常用的腫瘤基因治療載體。

腺病毒作為腫瘤基因治療的載體，提高其對(duì)腫瘤細(xì)胞的感染效率及特異性是十分重要的。

有報(bào)道一種新型的腺病毒載體(Ad.IR)(SteinwaerderDS.et.al.Nature?medicine.2001?Feb；7(2)：240-243)將腺病毒載體中插入兩段倒置重復(fù)序列，可以使腺病毒在復(fù)制過程中發(fā)生可定位的同源重組，產(chǎn)生一個(gè)截短的基因結(jié)構(gòu)，使插入倒置重復(fù)序列中反向的外源基因可以正向表達(dá)。而這種腺病毒載體的復(fù)制只發(fā)生在快速生長的腫瘤細(xì)胞中。所以，被反向插入于腺病毒載體中的外源基因即可以特異性的表達(dá)于腫瘤細(xì)胞中，如果外源基因是具有殺傷性的治療基因，則其在其中表達(dá)的腫瘤細(xì)胞就會(huì)被殺死。

對(duì)于腫瘤基因治療載體，一方面要求其可以在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)外源基因；另一方面，也希望其能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性復(fù)制、產(chǎn)生子代病毒侵染周圍未被感染的腫瘤細(xì)胞，提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。同時(shí)，要求其在正常細(xì)胞中盡可能不復(fù)制，減低對(duì)正常細(xì)胞的殺傷。為達(dá)到這兩個(gè)目的，將Ad.IR腺病毒載體與5型腺病毒E1a基因結(jié)合將會(huì)產(chǎn)生一個(gè)理想的結(jié)果。

5型腺病毒E1a基因位于病毒基因組左端，具有有84％的保守性。E1a編碼兩個(gè)主要的蛋白，一個(gè)有243個(gè)氨基酸(12S，243R)，一個(gè)有289個(gè)氨基酸(13S，289R)。E1a-12S和E1a-13S蛋白通過激活病毒基因的表達(dá)促使病毒復(fù)制。(Shenk，T。1996。Adenoviridea，P.2111-2148。)E1a-12S和E1a-13S蛋白是腺病毒最初表達(dá)的兩個(gè)蛋白，具有激活腺病毒其它基因，特別是E2區(qū)和E4區(qū)基因的功能，而這兩個(gè)區(qū)的功能是有關(guān)腺病毒的復(fù)制。

E1a直接活化細(xì)胞基因，誘導(dǎo)細(xì)胞DNA復(fù)制，與細(xì)胞周期調(diào)控蛋白質(zhì)pRb，pRb相關(guān)蛋白(P107/P130)或P300相互作用。

E1a與pRb家族蛋白分子的結(jié)合，釋放出E2F家族的轉(zhuǎn)錄因子，造成宿主細(xì)胞中一些有關(guān)DNA合成的基因被正向調(diào)控，使靜止期細(xì)胞進(jìn)入S期。這些和一些其它在S期激活的細(xì)胞因子，產(chǎn)生了一個(gè)適合病毒DNA合成的環(huán)境。在正常細(xì)胞中，E1a誘導(dǎo)細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控造成P53蛋白的累積，刺激P53介導(dǎo)G1期細(xì)胞停滯(el-Deiry，W.S.et.al.，1993.Cell.75：817-25；Xiong，Y.et.al.1993.Nature，36.6：701-4)或進(jìn)入細(xì)胞凋亡途徑。另外，E1a誘導(dǎo)的調(diào)亡也能通過不依據(jù)P53途徑發(fā)生。(Teodoro，J.G.et.al.1995.Oncogene.11：467-74)

E1a基因過去曾被認(rèn)為是一個(gè)癌基因，可使動(dòng)物胚胎細(xì)胞發(fā)生永生化，并可與其他病毒或細(xì)胞的癌基因相互作用。