[發(fā)明專利]用于產(chǎn)前診斷的蛋白質(zhì)芯片及制造方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 01126115.3
• 申請日: 2001-07-12
• 公開（公告）號: CN1330271A
• 公開（公告）日: 2002-01-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張濤;李賓;彭永濟(jì);任一萍;葛海鵬;鄧富橋
• 申請（專利權(quán)）人: 上海晶泰生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 上海東亞專利事務(wù)所
• 代理人: 董梅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明用于產(chǎn)前診斷的蛋白質(zhì)芯片及制造方法，涉及生物芯片技術(shù)。蛋白質(zhì)芯片是一種在固態(tài)基底上有序排布的蛋白質(zhì)或多肽陣列，以實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)進(jìn)行并行檢測、識別、鑒定和診斷的器件。可應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及其相關(guān)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

弓形蟲(Toxoplasma)、風(fēng)疹(Rubella)、巨細(xì)胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)、單純皰疹病毒(Herpes?Simplex?Virus，HSV，1型和/或2型)是對孕婦進(jìn)行產(chǎn)前檢查的五項(xiàng)重要指標(biāo)，簡稱ToRCH。ToRCH是一組廣泛傳播的病原微生物，孕婦由于內(nèi)分泌的改變和免疫力下降，易發(fā)生原發(fā)感染和復(fù)發(fā)感染，并可通過胎盤、產(chǎn)道或母乳傳染給胎兒或新生兒。胎兒感染可導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎或胎兒生長遲緩和畸形；新生兒感染可造成智力障礙以及癱瘓、失明、失聰?shù)葒?yán)重后遺癥。其中，子宮內(nèi)弓形蟲感染可導(dǎo)致新生兒嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和視覺障礙；風(fēng)疹感染可導(dǎo)致胎兒死亡或先天性白內(nèi)障、心臟病、青光眼、耳聾等；CMV感染可誘導(dǎo)肝炎、肺炎或單核細(xì)胞增多癥等；HSV感染后雖然通常臨床癥狀不明顯，可是對新生兒或免疫能力不足者可致命。因此五項(xiàng)若在孕期感染，只其中一項(xiàng)即可使胎兒產(chǎn)生嚴(yán)重缺陷。ToRCH診斷對于了解孕婦的免疫力和胎兒的健康狀況有著積極的作用，是孕婦必檢的項(xiàng)目之一。

目前臨床上進(jìn)行ToRCH診斷的方法主要是用酶聯(lián)免疫分析技術(shù)(Enzyme-Linked?Immunoassay，EIA)的方法檢測血清中上述各項(xiàng)的抗體(IgG或IgM)。具體地說，當(dāng)檢測IgG時(shí)，酶標(biāo)板上包被該項(xiàng)目相應(yīng)的抗原，與血清中相應(yīng)的IgG孵育結(jié)合，然后加入酶標(biāo)二抗，最后加入底物顯色，與陰性對照比色以判斷結(jié)果；當(dāng)檢測IgM時(shí)，酶標(biāo)板上包被該項(xiàng)目相應(yīng)的二抗，與血清中相應(yīng)的IgM孵育結(jié)合，然后依次加入抗原、酶標(biāo)抗體，最后加入底物顯色，與陰性對照比色以判斷結(jié)果。

ToRCH的ELISA試劑盒，目前有兩種，一種是逐項(xiàng)進(jìn)行檢查，也就是分別需要10個試劑盒將所有的IgM和IgM檢測完畢，每次反應(yīng)只能檢測一個指標(biāo)，速度慢，效率低；另一種試劑盒將五項(xiàng)IgG或IgM的指標(biāo)混合在一起，只要最終比色超過陰性對照，就判斷為感染，但無法確定哪一項(xiàng)指標(biāo)異常，如果需要確診，還要重新逐項(xiàng)檢測。因此ELISA方法進(jìn)行ToRCH診斷費(fèi)時(shí)費(fèi)力，另外，其靈敏度也有局限，實(shí)驗(yàn)中所用底物也是劇毒化學(xué)品，對實(shí)驗(yàn)人員造成威脅。

????????????????????發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于把ToRCH五項(xiàng)指標(biāo)的抗原同時(shí)點(diǎn)陣于一張玻璃片上，僅僅通過一次反應(yīng)即可得到多種指標(biāo)的逐項(xiàng)反應(yīng)結(jié)果，因而大大提高檢測的速度和效率。

本發(fā)明采用了以下兩項(xiàng)專利的技術(shù)：用于免疫分析的蛋白質(zhì)芯片(申請?zhí)枺?1105795.5)；多樣品微陣列生物芯片(申請?zhí)枺?1112783.X)。利用高速全自動點(diǎn)樣機(jī)器人把ToRCH五項(xiàng)指標(biāo)的抗原以及陽性對照、陰性對照點(diǎn)陣于多樣品微陣列生物芯片的同一個腔室內(nèi)，蛋白質(zhì)通過化學(xué)鍵連接于固相載體(經(jīng)戊二醛活化的玻璃)上而被固定，多樣品微陣列生物芯片的每一個腔室均點(diǎn)陣了上述五項(xiàng)指標(biāo)的抗原。

ToRCH五項(xiàng)指標(biāo)分別為弓形蟲、風(fēng)疹、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病(1型和2型)；在固相載體上點(diǎn)陣的抗原為純化的上述寄生蟲或病毒的特征性抗原。陰性對照采用牛血清白蛋白(Bovine?SerumAlbumin，BSA)，陽性對照采用人類免疫球蛋白G或M(IgG/IgM)，

將病人血清滴加于芯片表面，病人血清中的抗體分別與固定在芯片上的相對應(yīng)的抗原結(jié)合，洗去未結(jié)合的其他物質(zhì)后，加入熒光標(biāo)記的二抗，在測血清IgG的腔室里，二抗采用抗IgG二抗，在測血清IgM的腔室里，采用抗IgM二抗。洗去未結(jié)合的二抗，樣品點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與血清中抗體濃度大小成正比。用這種蛋白質(zhì)芯片可以分別檢測到血清中針對ToRCH五項(xiàng)指標(biāo)的IgG和IgM。

用于產(chǎn)前診斷的蛋白質(zhì)芯片的制造方法：(1)根據(jù)樣品數(shù)目選擇合適的多樣品微陣列生物芯片，確定每個樣品對應(yīng)的檢測IgG和IgM的腔室，作好記號，并確定點(diǎn)陣的排列方式和點(diǎn)樣位置；(2)點(diǎn)樣針從多孔板取出蛋白質(zhì)樣品(各項(xiàng)指標(biāo)的抗原)后直接高密度點(diǎn)印于醛基化的玻璃片上；(3)室溫過夜或37℃溫育1小時(shí)，使蛋白質(zhì)的氨基和玻璃片上的醛基發(fā)生縮合反應(yīng)，以固定樣品；(4)利用制作蛋白質(zhì)芯片的常規(guī)方法封閉、洗滌、干燥、包裝、保存。