[發(fā)明專利]乙型肝炎病毒基因分型和基因變異診斷芯片

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 01116078.0
• 申請(qǐng)日: 2001-05-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN1339608A
• 公開(kāi)（公告）日: 2002-03-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳瑞陽(yáng);高英堂;陳力;宋文芹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津南開(kāi)基因工程有限公司;南開(kāi)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 天津市學(xué)苑有限責(zé)任專利代理事務(wù)所
• 代理人: 趙尊生

本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)體外診斷技術(shù)，具體地講是一種基因芯片。

目前在臨床上已開(kāi)展的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有三大類，即組織培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法(酶聯(lián)免疫吸附ELISA和放射免疫法RIA)以及基因診斷技術(shù)(斑點(diǎn)雜交和聚合酶鏈反應(yīng)PCR)。這些方法對(duì)病毒性肝炎的診斷起到了非常積極的作用，但也有不足之處：(1)組織培養(yǎng)法對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求高，一般醫(yī)院難以開(kāi)展，并且周期長(zhǎng)，只能區(qū)分病毒的種。(2)ELISA和RIA檢測(cè)往往只能間接推測(cè)病毒在體內(nèi)的感染狀況，不能直接判斷是否存在以及病毒數(shù)量。(3)PCR和斑點(diǎn)雜交雖可直接檢測(cè)病毒基因組本身，甚至可以用來(lái)分析基因型和變異株，但由于對(duì)儀器、試劑及場(chǎng)地等要求條件較高，以及方法學(xué)上尚有欠妥之處，難以滿足臨床的大量篩查。并且從目前已獲得的結(jié)果看，各實(shí)驗(yàn)室之間利用基因診斷技術(shù)檢測(cè)肝炎病毒的結(jié)果很難取得一致，也缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。(4)上述方法共同的缺點(diǎn)是要檢查多個(gè)肝炎病毒標(biāo)志物時(shí)，只能一項(xiàng)項(xiàng)去做，耗時(shí)費(fèi)力，并且抽取患者的血量也較大。上述不足提示我們，多種檢測(cè)項(xiàng)目用一種儀器一次性檢測(cè)，并實(shí)現(xiàn)程序化和自動(dòng)化是診斷病毒性肝炎的研究方向之一。近年新興的生物芯片技術(shù)對(duì)解決此問(wèn)題給我們帶來(lái)極大的希望。

我國(guó)是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，全國(guó)乙型肝炎病毒攜帶者至少有1.3億以上，每年的發(fā)病率在6000萬(wàn)人次，乙肝病毒持續(xù)感染最終轉(zhuǎn)化為慢性肝炎、肝硬化或肝癌；總數(shù)約占世界感染者的40％。因此，我國(guó)自“六五”以來(lái)，一直將研究和開(kāi)發(fā)肝炎病毒的新診斷技術(shù)和診斷試劑作為醫(yī)學(xué)攻關(guān)項(xiàng)目，并取得了一定的進(jìn)展。但隨著研究的深入，人們對(duì)肝炎病毒的認(rèn)識(shí)也不斷加深，乙肝病毒基因的變異、不同位點(diǎn)的突變可引起不同后果，如免疫逃避、疫苗逃避和抗病毒治療逃避，在臨床表現(xiàn)為漏診、盲目用藥和延誤治療，最終導(dǎo)致患者多花錢而使病情加重。最新研究結(jié)果表明，乙肝病毒的基因型與病情的輕重相關(guān)，抗病毒藥物引起乙肝病毒特定位點(diǎn)的變異而耐藥等。但是目前臨床常規(guī)的檢測(cè)方法越來(lái)越不適應(yīng)臨床診治的需要，這就需要研究更新的、更能反映肝炎病毒實(shí)際狀況的試劑或儀器、方法等，對(duì)肝炎病毒感染狀況進(jìn)行準(zhǔn)確判斷，并指導(dǎo)臨床治療方案的制定。

本發(fā)明的目的是提供一種乙型肝炎病毒基因分型和基因變異診斷芯片，該基因芯片具有診斷準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、信息量高的特點(diǎn)，是目前乙肝病毒感染診斷最好的手段，給數(shù)千萬(wàn)乙肝患者帶來(lái)福音。此芯片成功應(yīng)用于臨床，其潛在市場(chǎng)巨大，并能帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

本發(fā)明是在基質(zhì)尼龍膜上設(shè)置探針，探針在膜上的步陣，與核苷酸類似物等抗病毒藥物的耐藥相關(guān)探針.；與免疫逃亡，臨床漏檢有關(guān)的探針；與干擾素應(yīng)答，免疫逃避，臨床狀況有關(guān)的探針；與病毒復(fù)制和原發(fā)性肝癌相關(guān)的缺失突變等特異性探針100-1000個(gè)左右，在特異探針末端加一段特異引物。

本發(fā)明實(shí)施的具體步驟是：

1.設(shè)計(jì)乙肝病毒特異性探針100-1003個(gè)。

乙肝病毒基因組大小為3.2kb，P區(qū)從2357核苷酸開(kāi)始-1621個(gè)核苷酸位置終止，在這段基因組中設(shè)計(jì)探針117-381個(gè)，S區(qū)：分為三段，S1：2848-3172，S2：3173-155，S：156-833核苷酸，設(shè)計(jì)探針52-137個(gè)，C區(qū)分為前C區(qū)和C區(qū)，從1814-1901-2450個(gè)核苷酸，設(shè)計(jì)探針177-380個(gè)，X區(qū)1374-1818個(gè)核苷酸之間，設(shè)計(jì)探針37-115個(gè)。探針的大小8-25個(gè)堿基。

2.合成探針：使用上海生物工程有限公司DNA合成儀合成。

3.探針處理：由于設(shè)計(jì)的探針比較短，很難固化在膜上，因此我們?cè)?’末端加了一個(gè)尾巴，使它能夠固化在尼龍膜上。

4.基因芯片的制備

使用羅氏公司生產(chǎn)的帶有正點(diǎn)荷的尼龍膜，使用南開(kāi)大學(xué)設(shè)計(jì)的NKG-Microarray?III點(diǎn)樣儀(如圖1所示)按預(yù)先設(shè)定好的順序進(jìn)行點(diǎn)樣(見(jiàn)表2，表2是乙型肝炎病毒基因分型和基因變異診斷芯片合成的引物序列)。

圖1是基因芯片微點(diǎn)陣操作平臺(tái)示意圖。

如圖所示，1為點(diǎn)樣臂，為有機(jī)玻璃制作，可以是一個(gè)以上；2為精密平移臺(tái)，為一維精密操縱器；3為點(diǎn)樣頭架，有機(jī)玻璃制作，用于裝載針架；4針架；5為精密電控平移臺(tái)Z軸；6為精密電控平移臺(tái)Y軸；7為精密電控平移臺(tái)X軸；8為光學(xué)平臺(tái)；9為電控箱；10為計(jì)算機(jī)；利用計(jì)算機(jī)控制軟件通過(guò)電控箱操作機(jī)械手自動(dòng)化點(diǎn)樣。

尼龍膜大小：1.0-2.5cm×5cm，點(diǎn)數(shù)，按照不同的要求從幾十點(diǎn)到千點(diǎn)，依針管徑粗細(xì)點(diǎn)的大小為100-1000微米，點(diǎn)間的距離為200-1500微米，每點(diǎn)上樣量為0.05-0.1微升。