[發明專利]檢測外周血抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞的方法及試劑盒

無效

• 申請號: 01115916.2
• 申請日: 2001-05-22
• 公開（公告）號: CN1387046A
• 公開（公告）日: 2002-12-25
• 發明（設計）人: 王恒
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院基礎醫學研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/576;G01N33/574
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司
• 代理人: 林曉紅

本發明涉及分子免疫學和細胞免疫學領域，更具體地，本發明涉及體外檢測抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞的新方法，利用該方法的試劑盒及其應用。

細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic?T?Lymphocyte，CTLs)通過識別細胞表面主要組織相容性復合物(major?histocompatibility?complex，MHC)I類分子及其結合的抗原肽而殺傷靶細胞，是機體抗腫瘤、抗移植物及有效控制各種感染的重要免疫防御反應之一。抗原特異性CTLs所能識別的抗原主要是來源于內源性蛋白抗原降解后結合于MHC?I類分子上的肽段。MHC?I類分子是由具有高度多態性的重鏈及保守的輕鏈即β₂微球蛋白組成的異源二聚體，在所有有核的細胞中表達，在人中MHC?I類分子的重鏈由稱為人白細胞抗原(HLA)的分子組成。與MHC?I類分子結合的抗原短肽在抗原遞呈細胞(APC)內被加工(內源性抗原)，在細胞的內質網中結合于MHCI類分子重鏈的α1和α2功能區構成的肽結合槽(groove)內，β₂微球蛋白與重鏈通過非共價結合并起穩定MHC?I類分子-肽復合物的作用，然后定位于細胞表面，抗原特異性CTLs通過其表面的αβ型T細胞受體(TCR)和MHC?I類分子-肽復合物的相互作用來識別被感染的細胞，進而殺傷感染細胞。近年來對特異性CTL反應在防治愛滋病、瘧疾以及抗腫瘤中的重要作用有大量報道。

生物技術產業的發展使得癌癥、自身免疫性疾病和感染性疾病的新的免疫治療方法得到了迅速的發展。疫苗免疫或免疫治療后進行定量或定性CTL反應檢測抗原及時對治療效果進行評估，從而為臨床治療提供有力的依據。由此，迫切需要簡便、易行、靈敏的方法對CTL的數量和功能進行評估。目前檢測抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞的方法主要有以下幾種：①細胞毒性分析方法，即經典的⁵¹Cr釋放分析法、LDA；②細胞因子檢測法，例如酶聯免疫印記分析方法、細胞內細胞因子染色法；③特異T淋巴細胞受體(TCR)的聚合酶鏈反應(PCR)；以及④可溶性MHC-肽四聚體方法。由于對某一MHC-肽復合體具有特異識別作用的CTLs在外周血淋巴細胞中的比率很低，因此檢測這些低頻率的特異性CTLs需要有高敏感度的方法。細胞毒性分析方法和細胞因子檢測法是間接檢測抗原特異性CTLs的方法，要求有大量的特異性CTLs作為效應細胞，因此需要首先在體外進行擴增，致使這兩種方法周期長、敏感性低、費時費力，難以廣泛應用。TCR的聚合酶鏈反應是一種基于PCR技術的方法，其敏感性高，但是只能應用于已知TCR基因型的特異CTLs檢測，因此在很大程度上限制了該方法的應用。可溶性MHC-肽四聚體法(Altman，J.D.et?al.Science?274，94-6.(1996))是目前最新的直接檢測抗原特異性CTLs的方法，然而，盡管四聚體可以同時與四個TCR結合，雖然減慢了它們的解離率，卻沒有從根本上解決解離率快的問題。因為可溶性MHC-肽復合物單體與TCR的解離率很快，也就是說它一旦與TCR結合后在幾秒鐘內就又與TCR解離。在四聚體與特異性CTLs孵育后，不可避免地要進行沖洗，從而減低流式細胞儀檢測背景，提高陽性檢出率。沖洗本身打破了結合在細胞表面的四聚體和游離的四聚體之間的平衡，使結合在細胞表面的四聚體與TCR解離速度增加。可以設想，沖洗后隨著時間的延長，結合在特異性CTL表面的四聚體將越來越少，使得流式細胞儀的檢測結果靈敏度降低，陽性檢出率下降。另外，此方法的操作過程仍然很復雜，構建四聚體要經過三次蛋白純化，大大增加了蛋白的損失量，因此必須提高原核細胞的蛋白表達量以滿足需求，造成實驗步驟繁瑣，消耗大量人力物力，影響了此法在臨床檢測和動物實驗中的簡便性和實用性。

本發明人針對四聚體的這些缺點進行了創新，利用一種苯甲酮類光交聯劑的化學試劑，使MHC-肽復合物不可逆地與TCR結合，從而不需可溶性MHC-肽四聚體，僅用MHC-肽單體即實現了抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞的簡便、靈敏、結果可靠的檢測。

因此，本發明的一個目的在于提供檢測外周血抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞的一種新方法。

本發明的另一目的在于提供一種檢測外周血抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞的試劑盒，該試劑盒利用本發明的方法進行檢測。

本發明的再一目的在于提供本發明方法在診斷或輔助診斷及預后感染性疾病、腫瘤、同種異體移植排斥反應中的應用及在評價疫苗中的應用。