[發明專利]鼻咽癌惡性轉化基因Tx基因DNA序列及其測定方法

無效

• 申請號: 01114446.7
• 申請日: 2001-04-30
• 公開（公告）號: CN1367246A
• 公開（公告）日: 2002-09-04
• 發明（設計）人: 曹亞;廖偉;黎明;任維;夏林慶;翁新憲;鄧錫云
• 申請（專利權）人: 中南大學湘雅醫學院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/12;C12N15/63;A61P35/00
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務所
• 代理人: 趙洪,謝新元

本發明公開了鼻咽癌惡性轉化基因Tx基因的DNA序列，屬于人類惡性腫瘤分子生物學研究領域。

新近國內幾個研究小組幾乎同時發現上皮來源的腫瘤細胞表達免疫球蛋白。國外僅有一篇文章進行報道。即Kimoto報道：用敏感的巢式PCR技術發現癌上皮細胞中存在免疫球蛋白C區及TCR基因的重組，并進一步推測有相應蛋白的存在。但迄今為止，還未見報道在癌細胞中克隆到所表達的免疫球蛋白的基因。本發明首次從癌細胞中克隆了一個與免疫球蛋白kappa輕鏈基因高度同源的Tx基因，而且證明該基因具有惡性轉化功能。本發明的鼻咽癌惡性轉化基因Tx基因是世界首次克隆、測序獲得的，并在美國基因數據庫GenBank登錄(登錄號：AF269073)。

本發明的目的是通過所克隆的鼻咽癌惡性轉化基因Tx，探討癌細胞表達免疫球蛋白的機理以及調控Tx基因表達的因素，以闡述癌細胞表達免疫球蛋白的生物學意義，為細胞癌變機理的研究提供一條新的思路。

實現本發明目的的方法是首先克隆Tx基因的gDNA。將人鼻咽癌細胞株CNE2的gDNA打斷成9-22kb的片段，重組到載體λDash，轉染JB6細胞株，挑取在軟瓊脂上形成的陽性克隆，提取該陽性克隆的gDNA再轉染JB6細胞株，經過這樣的三次篩選后，將所獲得的陽性克隆建立gDNA文庫，用人的重復序列Alu作為探針，篩選此文庫，得到一個長約16kb的gDNA序列，即Tx基因。

附圖說明：圖1為Tx基因的酶切圖譜圖。

以下對本發明基因進行克隆并測序方法作進一步說明。

Tx基因的克隆方法是：采用EB病毒陰性的CNE2鼻咽癌細胞系作為克隆惡性轉化基因的來源。用含有7.5％胎牛血清(FBS)的BEM(基礎Eagel`s培養基)培養CNE2細胞，提取該細胞的gDNA(15μg)，磷酸鈣沉淀轉染到2×10⁵受體細胞JB6中，轉染一天，并培養三天后，將5×10⁴個細胞或2.4×10⁶個細胞重懸于含5％FBS的0.33％瓊脂中，分別置于100-mm或60-mm培養皿中培養12天，計數大于8個細胞的克隆數，扣除陰性對照值(無DNA或無受體細胞DNA)即為停泊非依賴生長的陽性克隆數。從瓊脂中挑取最大的細胞克隆，作為轉染的細胞，再進一步進行克隆增殖。提取這些克隆的DNA并純化以進行下一輪的轉染。將提取的DNA中的16kb片段用脂質體法與pSV2共轉染JB6受體細胞，新霉素抗性細胞選擇性生長于含G418(500ug/ml)的5％TMEM中，培養2周，其間每三天換液一次，于0.33％瓊脂中挑取3.6×10⁴抗性細胞即獲得停泊非依賴生長細胞。傳代3-4代的抗性細胞系重懸于含10％FBS的0.33％瓊脂中，置于60-mm培養皿中。14天后，計數大于8個細胞的陽性克隆數。用Mbol將經過三輪轉染的細胞的DNA作部分消化，通過蔗糖梯度離心法分離其中的9-22kb的片段，用T4連接酶用dGTP和dATP部分填平這些片段，另外用Xhol消化λdash載體臂(10ug)，純化后，用dTTP和dCTP部分填平末端，將兩者進行重組，(從而形成了Sal?1限制性酶切位點，這樣有利于從載體中分離插入片段)用Gigapack?Gold?packaging?extract(stratagene?Inc.)包裝此重組體，選擇性轉化p2392大腸桿菌。此未擴增文庫容量為8×10⁶重組噬菌體。噬菌體經擴增后，此gDNA文庫滴度為1.4×10¹⁰pfu/ml。

用人的Alu重復序列作為探針，篩選噬菌體文庫，選取陽性克隆，用Sal?1完全消化其DNA，于凝膠中純化16-kb的插入片段，將之命名為Tx基因(鼻咽癌惡化轉化基因)。

所克隆的鼻咽癌惡性轉化基因Tx基因進行序列測定的方法是：

將Tx基因分別用Sal?I、Xho?I、EcoR?I進行酶切，獲得五個酶切片段，分別是Sal?I/Xho?I?Tx1.3，Xho?I/EcoRI?Tx3.0、EcoRI/EcoRI?Tx?1.0、EcoR?I/EcoR?I?TX2.8和EcoR?I/Sal?I?Tx6.0。酶切圖譜如圖1所示。