[發(fā)明專利]柯薩奇病毒B分型免疫球蛋白抗體G酶免盒及制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 01112708.2
• 申請(qǐng)日: 2001-04-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN1382990A
• 公開(kāi)（公告）日: 2002-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 杜鳳鳴
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杜鳳鳴
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/531
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/531
• 代理公司: 上海新天專利代理有限公司
• 代理人: 王巍

1.一種柯薩奇病毒B1-6分型抗體IgG試劑盒，其特征在于該試劑盒用CoxB病毒B1-6分型抗原包被，兔抗人IgG聯(lián)接辣根過(guò)氧化物酶為檢測(cè)抗體，檢測(cè)血清中的CoxB病毒B1-6分型抗體IgG，并且試劑盒由下列組成：預(yù)包被反應(yīng)條???48孔/96孔(盒)?酶結(jié)合物工作液；?1瓶(10ml)樣品稀釋液?????1瓶(6ml)??????陽(yáng)性對(duì)照?????????1支(200μl)陰性對(duì)照???????1支(200μl)???20倍濃洗滌液?????1瓶(13ml)顯色劑A????????1瓶(3ml)??????顯色劑B??????????1瓶(3ml)終止液?????????1瓶(3ml)

2.一種如權(quán)利要求1所述的一種柯薩奇病毒B1-6分型抗體IgG試劑盒的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟：一、原材料及其規(guī)格

CoxB病毒B1-6分型IgG抗原的包被；酶標(biāo)板：華東理工大學(xué)ELISA測(cè)定CV(％)＜10％陽(yáng)性對(duì)照：診斷心肌炎患者血清，用本試劑盒測(cè)定A值＞0.8，放置-20

??????℃?zhèn)溆茫魂幮詫?duì)照：選正常人血清，用本試劑盒測(cè)定A值＜0.09，放置-20℃?zhèn)?/p>

??????用；酶標(biāo)抗體：兔抗人IgG-HRP，(辣根過(guò)氧化物酶，RZ＞3.0?Sigma進(jìn)口)酶標(biāo)記兔抗人IgG，雙擴(kuò)散1∶64；小牛血清：杭州四季清廠生產(chǎn)；其它試劑：

Na₂CO₃????????????????A.R

NaHCO₃?????????????????A.R

小牛血清?????????????????杭州四季清廠生產(chǎn)

Na₂HPO₄·12H₂O???????A.R

NaH₂PO₄·2H₂O????????A.R

NaCL????????????????????A.R

Tweel-20????????????????化學(xué)純

甘油????????????????????化學(xué)純

H₂O₂??????????????????A.R

檸檬酸.H₂O??????????????A.R

TMB??????????????????????熔點(diǎn)：168℃

EDTA?????????????????????A.R

H₂SO₄?????????????????A.R

Tris????????????????????A.R蒸餾水必需符合《中國(guó)藥典》(1990)之規(guī)定細(xì)胞及動(dòng)物要求：(1)Hela細(xì)胞(ATCC????CCL-2)(2)新西蘭大白兔?????2公斤左右二、包被抗原(CoxB病毒1-6分型抗原)的制備；(一)CoxB病毒1-6型的制備(1)CoxB病毒1-6型毒種來(lái)源：昆明生物所(2)Hela細(xì)胞來(lái)源：中科院細(xì)胞所(3)細(xì)胞傳代：①培養(yǎng)劑配制：

PRMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)過(guò)濾除菌，200ml基礎(chǔ)培養(yǎng)劑中含：牛血清10％

青霉素4萬(wàn)單位

鏈霉素4萬(wàn)單位

6％NaHCO3?4ml

3％谷氨酰胺?6ml②胰酶(DT)配制：

用無(wú)Ca、Mg離子溶液配制0.3％胰酶消化液，用分散、消化細(xì)胞；③細(xì)胞傳代：

將成片的細(xì)胞傾去培養(yǎng)液，加入DT進(jìn)行細(xì)胞消化，觀察細(xì)胞已呈疏松網(wǎng)狀，既倒去DT，加入營(yíng)養(yǎng)液后，分瓶培養(yǎng)培養(yǎng)3-5天；(4)CoxB1-6型病毒的感染、培養(yǎng)、收毒和鑒定：①將形態(tài)完整、成片的單層細(xì)胞傾去培養(yǎng)液后，用不含牛血清的洗??液洗一次；②細(xì)胞感染病毒后，在37℃吸附1小時(shí)；③補(bǔ)充培養(yǎng)液，在37℃培養(yǎng)；④逐日觀察細(xì)胞：至所有細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變后，用無(wú)菌方法收獲病??毒；⑤微量平底板進(jìn)行病毒濃度的滴定和病毒鑒定；病毒滴定：

用10倍的倍比稀釋的方法進(jìn)行病毒的稀釋，病毒加入微量板中，每孔加50μl病毒，每個(gè)稀釋度加4孔，然后加入細(xì)胞50μl，設(shè)細(xì)胞對(duì)照，按Reed-Muench方法計(jì)算病毒的TCID50；病毒的鑒定：

應(yīng)用免疫電鏡法和應(yīng)用中和試驗(yàn)方法(微量滴定法)

1-6型病毒取100TCID50，加入含抗血清的孔內(nèi)，25μl/孔，抗血清作1∶4-1∶1024連續(xù)4倍稀釋，25μl/孔，每個(gè)稀釋度4孔，將板加蓋，37℃中培育2小時(shí)；然后每孔內(nèi)加Hela細(xì)胞50μl，同時(shí)設(shè)病毒陰性、陽(yáng)性對(duì)照，逐日觀察細(xì)胞病變；是同型的病毒，能被抗血清中和、而不出現(xiàn)CPE；(5)抗原的制備、濃縮和純化：①病毒滅活；②去除病毒碎片：用冷凍離心的方法去除細(xì)胞碎片；③初步濃縮、提純：用PEG方法進(jìn)行提純；④1-6型病毒的進(jìn)一步純化：用葡聚糖過(guò)柱、洗脫的方法，然后在??A280的分光光度計(jì)進(jìn)行1-6型病毒蛋白含量的測(cè)定；三、兔抗人IgG(r)的制備(1)人IgG(r)鏈的制備(2)30ml人臍帶混合血清，50％及33％飽和硫酸銨各鹽析1次，???PH7.2PBS透析去鹽，體積濃縮至30％；(3)過(guò)Sephadex?G200柱，PH8.0?0.2M?Nacl-0.1Mtris緩沖液洗???脫，分管收集，第二峰為IgG；(4)雙擴(kuò)散法鑒定IgG純度；(5)10mM疏基乙醇4℃?3h解離輕鏈，對(duì)PB透析24h；(6)再過(guò)Sephadex?G200柱，洗脫液同上，收集第一峰IgG(r)鏈；(7)雙擴(kuò)散鑒定r鏈特異性；(8)光密度法測(cè)定IgG(r)濃度；(9)抗r鏈特異性抗體的制備；(10)1mg/ml?r鏈加等量福氏完全佐劑研缽中研磨乳化；(11)每只兔頸背部多點(diǎn)注射3mg?r鏈抗原，2周-1個(gè)月1次，共

5-8次，雙擴(kuò)散效價(jià)達(dá)1∶64以上時(shí)采集血清；(12)辛酸法純化抗血清IgG部分蛋白定量；四、酶標(biāo)記抗體制備

兔抗人IgG(r)用過(guò)碘酸鈉法與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)對(duì)PBS充分透析，加等體積甘油，-20℃以下保存，效價(jià)＞1∶1000(用方陣滴定法測(cè)定)；五、酶標(biāo)記兔抗人IgG(r)濃度測(cè)定

采用方陣滴定法選擇酶標(biāo)記抗體工作濃度為1∶2000六、預(yù)包被抗原板及試劑盒原料的制備(10包被

Na₂CO₃????????0.6g

Na₂HCO₃???????1.58g

重蒸水??????????500ml

加入適量CoxB病毒1-6分型6型抗原，分別調(diào)整PH至9.5加入各型板條各孔中，置濕盒中加蓋，4℃過(guò)夜后甩干；(2)洗滌

Tris????????????2.42g

重蒸水??????????1000ml

加入板條各孔中，靜置5秒后甩干，上述操作重復(fù)3次，以除去剩余抗原；(3)封閉

蔗糖????????????100g

羊血清??????????25ml

0.1MPBS?????????1000ml

加入各型板條各孔中放入濕盒中(加蓋)37℃2h，棄去液體，吸水紙上拍干重復(fù)一次，待干燥后，放入有干燥劑的塑料袋封口，保存于4℃；(4)陽(yáng)性對(duì)照制備

診斷心肌炎患者的血清，60℃放置1小時(shí)，除菌過(guò)濾，用本試劑盒測(cè)定A值＞0.8備用，分裝；(5)陰性對(duì)照的制備

正常人血清用本試劑盒測(cè)定A值0-0.09用萬(wàn)分之二硫柳汞防腐備用分裝；(6)酶標(biāo)記抗體配制

??????????????????????30％小牛血清

兔抗人IgG(r)-HRP??????50％0.15MPBS

(稀釋度1∶2000)???????20％甘油

?????????????????——————————→稀釋20倍分裝(7)酶標(biāo)記抗體稀釋液

小牛血清???????????30ml

0.15MPBS???????????50ml

甘油???????????????20ml

20％Tween-20???????2.5ml

調(diào)PH至7.2(8)顯色劑A

Na₂HPO₄.12H₂O??1.7g

檸檬酸.H₂O????????0.5g

3％H₂O₂??????????200ul

重蒸水?????????????100ml

調(diào)PH至5.0(9)顯色劑B

EDTA???????????????17.5mg

檸檬酸.H₂O????????0.5g

重蒸水?????????????100ml

加入10mlDMSO含60mg?TMB的溶液25ul(10)終止液

濃H₂SO₄?????????????10ml

蒸餾水????????????????80ml(11)20X洗滌液

Tris??????????????????4.84g

重蒸水????????????????100ml七、半成品的檢定(1)包被板的檢定：CV(％)＜10％(n-10)(2)穩(wěn)定性檢定：①陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照+4℃-+8℃的穩(wěn)定性檢定

試劑盒內(nèi)設(shè)定陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照均+4℃-+8℃放置9個(gè)月，再用該試劑盒測(cè)定吸光度在正常范圍內(nèi)；②試劑盒37℃穩(wěn)定性檢定

裝配前一星期將兔抗IgG-HRP(1+100)(同一批CoxB病毒1-6型用IgG-HRP各檢測(cè)一次)置37℃，并于第1天，第3天，第5天，第7天各測(cè)定一次，并用兔抗人IgG-HRP置-20℃作對(duì)照，測(cè)得質(zhì)控血清7天基本不變，則可以使用；(3)特異性檢定：

用69份質(zhì)控參比血清來(lái)檢測(cè)半成品，陰性參比血清允許出現(xiàn)陽(yáng)性1份，陽(yáng)性參比血清允許出現(xiàn)陰性1份；

陰性質(zhì)控血清45份組成：T1-3：HAV抗體陽(yáng)性血清，T4-6：HCV抗體陽(yáng)性血清：T7-9：HEV抗體陽(yáng)性血清，T10-14：HBV表面抗體陽(yáng)性血清，T15-24：CoxB-IgM陰性血清，T25-27：類(lèi)風(fēng)濕因子陽(yáng)性血清，T28-30：TB陽(yáng)性血清，T31-33EBV陽(yáng)性血清，T34-36CMV陽(yáng)性血清，T37-39Hopl陽(yáng)性血清，T40-42抗核抗體陽(yáng)性血清，T43-45TOXO陽(yáng)性血清，用6型IgG包被板測(cè)定；45份特異性血清應(yīng)允許1份為陽(yáng)性；

陽(yáng)性質(zhì)控血清24份組成：Y1-24陽(yáng)性血清(CoxB-IgG1-6型每型陽(yáng)性血清4份)，24份陽(yáng)性血清，應(yīng)允許1份為陰性，其余23份應(yīng)檢測(cè)為陽(yáng)性；(4)靈敏度檢定①組成：

將中和實(shí)驗(yàn)效價(jià)高之CoxB-IgG陽(yáng)性血清選擇3份，分別編號(hào)為：L1#、L2#和L3#；L1#按以下稀釋度稀釋：

1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024L2#按以下稀釋度稀釋：

1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024，1∶2048L3#按以下稀釋度稀釋：

1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512②判斷標(biāo)準(zhǔn)：

6型對(duì)L1#靈敏度應(yīng)檢測(cè)到1∶32-1∶64

6型對(duì)L2#靈敏度應(yīng)檢測(cè)到1∶64-1∶128

6型對(duì)L3#靈敏度應(yīng)檢測(cè)到1∶16-1∶32(5)精密度測(cè)定

將同一樣品平行加樣10孔，其檢測(cè)值的1-6型每型1份其變異系數(shù)均小于15％(CV％＜15)；(6)酶標(biāo)抗體稀釋液，底物液經(jīng)過(guò)37℃細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)無(wú)菌生???長(zhǎng)；八、試劑盒組裝(1)上述制備步驟所用試劑用過(guò)濾器除菌過(guò)濾后超凈分裝；(2)試劑盒必需有外包裝盒，海棉墊，塑料瓶6瓶，eppenkof管2???支，包被板，說(shuō)明書(shū)，內(nèi)標(biāo)簽紙9張，外標(biāo)貼紙1張，批號(hào)lot/EXP，???48T/96T；九、成品檢定(1)物理檢查①藥盒外包裝，標(biāo)簽，批號(hào)，規(guī)格(48T/96T)有無(wú)遺漏；②藥盒內(nèi)試劑瓶完整無(wú)滲漏，試劑瓶數(shù)和說(shuō)明書(shū)無(wú)欠缺，標(biāo)簽完整，??有效期應(yīng)清楚明晰；③藥盒試劑(酶標(biāo)抗體稀釋液，顯色劑A，顯色劑B，洗滌液)核??對(duì)PH值及溶液是否澄清；(2)穩(wěn)定性檢定：完全同半成品檢定(3)特異性檢定：完全同半成品檢定；(4)靈敏度：完全同半成品檢定；(5)精密性：完全同半成品檢定；(6)抽樣合格后，留下5個(gè)試劑盒剩余入庫(kù)；

3個(gè)試劑盒

4℃??2個(gè)??隔一個(gè)月測(cè)定1次

37℃?1個(gè)??第一次隔三天測(cè)定1次，以后每星期測(cè)定1次，記

??????????錄數(shù)據(jù)，繪制圖表；

2個(gè)試劑盒留庫(kù)備查十、保存與有效期

保存于2-8℃，自檢定后合格之日起有效期為8個(gè)月。