[發明專利]從一種印度蚯蚓體腔液中得到的引起精子不能游動的蛋白

無效

• 申請號: 01112435.0
• 申請日: 2001-03-30
• 公開（公告）號: CN1377889A
• 公開（公告）日: 2002-11-06
• 發明（設計）人: 穆華·慕克吉;沙姆帕·比斯瓦斯;馬拉比卡·達塔;薩米爾·巴塔查里亞;蘭簡·巴德拉;阿洛科·帕爾
• 申請（專利權）人: 科學和工業研究委員會
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K1/14;A61K35/64;A61K38/17;A61P15/16;C12Q1/04
• 代理公司: 北京三友知識產權代理有限公司
• 代理人: 穆魁良

本發明涉及一種新穎的、從屬于節肢動物門的蚯蚓Pheretima?posthuma中分離到的、引起精子不能游動的蛋白，該蛋白可以作為抗致育因子。本發明還提供了從蚯蚓成熟樣本的體腔分離活性因子的方法，可以由普通方式從屬于節肢動物門的蚯蚓Pheretima?posthuma獲得成熟樣本，該因子可以作為抗致育因子。

控制人口爆炸是與發展中國家(如印度、中國)的進步密切相關的重要項目。市場上有一些避孕工具和試劑，這無疑有助于控制生育和控制人口，但大多數避孕工具和試劑或存在成功避孕問題，或存在毒副作用問題，因為避孕藥丸含有類固醇。因此，我們確實需要非常成功的裝置或產品，既可保證成功避孕，又不會引起毒副作用。

因此，各個國家都在嘗試得到這樣的產品，但迄今為止，還沒有一個國家獲得成功。在日本有這樣一個有趣的故事，東京大學的一位前名譽教授和一個調查小組開展了一項研究項目，研究從Eisenia?foetida的體腔液中得到避孕物質。取自日本蚯蚓Eisenia?foetida體腔液中的一種添加因子立即引起了包括人類在內的許多脊椎動物的精子游動停止。研究小組非常激動，繼續純化這種因子。他們發現該因子為一種蛋白質，并且是41kDa的單體蛋白質。此后，當他們又克隆出這種蛋白質的基因時，他們突然發現這種蛋白質具有很高的毒性(Sekizawa?et?al.，1996，Biomed.Res.，17(3)，197-203；Sekizawa?et?al.，1997，Gene，191，97-102；Yamaji?et?al.，1998，J.Biol.Chem.，273(9)，5300-5306；Kobayashi?et?al.，2000，J.Expl.Zool.，286，538-549)。將這些蛋白質注入老鼠的血液中，它們立即就死亡。在紅細胞的制備過程中添加這種蛋白質后，瞬間即導致細胞溶解。這次事故雖然未能使達到他們的目的，但是他們卻發現了這種蛋白質的另一面：即它具有抑制神經鞘磷脂的功效，神經鞘磷脂是存在于大多數脊椎動物細胞膜中的油脂。正是這種抑制力導致了細胞的溶解。不過，他們發現有一種像這些蛋白質一樣重要的高效神經鞘磷脂抑制蛋白質，但目前還無法獲取。這種蛋白質取名為“Lysenin”，因其所具有的神經鞘磷脂抑制功能而擁有極高的市場價值。該研究小組還發表了許多有關“Lysenin”的論文。

顯然，他們未能實現自己的主要目標，即將其用作抗致育因子從而獲得較高的商業利潤。

本發明的主要目的是從一種蚯蚓的體腔液中鑒別出一種因子，該因子能引起精子立即停止運動，并能用作抗致育因子。

本發明的另一個目的是提供一種與當前市售的其它表現出嚴重副作用的避孕劑相比較，完全無毒的混合物。

發明人的工作始于印度蚯蚓Pheretima?posthuma，抽提體腔液，并檢測它們對精子活動性的作用，發現它能夠與lysenin一樣有效，同樣立刻使精子停止運動。但二者存在著明顯的差異。印度蚯蚓體內的抽提物并不會造成小鼠、老鼠及兔子死亡。針對該種毒性進行的詳細、認真的試驗表明其對肝臟及其他組織并無有害影響。此外，在RBC準備中添加它們后并沒有像觀察“lysenin”時出現細胞菌溶解現象。因此，該抽提物能夠造成精子永久性地停止活動，而不至于產生任何副作用。在控制生育時使用這種優勢可以帶來巨大的商業利潤。

這種因子同樣也是蛋白質。申請人通過分子排斥色譜法(SG-100)將其加以凈化。由此可以得出：它是從一種印度蚯蚓體內提取的產品，并且應該得到保護。

附圖的簡要說明

圖1：體腔液經過SG100凝膠過濾柱的洗脫圖，得到PI、PII、PIII三個峰。檢測收集自每個峰的蛋白對精子活動性的作用。

圖2：PIII(凝膠色譜的活性峰)經過HPLC?DEAE柱的洗脫圖。得到一個不連續的小峰(DI)、和三個連續的峰(DII、DIII、DIV)，檢測收集自每個峰的蛋白對精子活動性的作用。

圖3：離子交換層析步驟這的活性部分的SDS-PAGE電泳，12％的分離膠和3.5％的濃縮膠。約3μg的蛋白溶于20μl樣品緩沖液中，樣品緩沖液含有0.01MTris，10％SDS，5％β巰基乙醇和0.1％溴酚藍(pH6.8)。100℃加熱5分鐘，加入凝膠，在50伏電壓下電泳。7μl預先染色的標準參照物(GIBCO-BRL)用于確定分子量。得到20千道爾頓(kDa)的單體蛋白(圖3)。

表格的簡要描述