[發明專利]用于紅細胞代用品的高純度無熱原無基質血紅蛋白的制備方法

無效

• 申請號: 01108643.2
• 申請日: 2001-07-17
• 公開（公告）號: CN1333296A
• 公開（公告）日: 2002-01-30
• 發明（設計）人: 楊成民;王紅;曾敏;劉嘉馨;劉利民;吳小晉;劉小平;劉錦蓉;張漫江;李莉
• 申請（專利權）人: 楊成民
• 主分類號: C07K14/805
• 分類號: C07K14/805;A61K35/14
• 代理公司: 四川省專利服務中心
• 代理人: 濮家蔚

技術領域

本發明涉及的是一種作為紅細胞代用品使用的高純度無熱原無基質血紅蛋白的制備方法。

背景技術

由于人類血型十分復雜，除各種抗原可能導致的輸血免疫反應難以克服外，肝炎、艾滋病等多種可經血液途徑傳播的傳染病對血液臨床直接使用構成的威脅也越來越大，因而在各種臨床醫療和急救中，對輸血的質和量的要求越來越高。此外，人血的體外保存和運輸問題也是影響將采集血液直接使用的重要制約因素。因此，研發和使用血液代用品已普遍受到重視。現在已明確，人類的血型反應來源于紅細胞膜上的抗原種類的不同，去除了紅細胞膜及其上所攜帶的各種血型抗原后的無基質血紅蛋白(Hb)類紅細胞代用品即可完全不存在配血型之憂，并且在制備過程中通過對病毒的滅活還可以消除各種隨血液傳播疾病的可能性。試驗表明，此種無基質血紅蛋白類紅細胞代用品在一般室溫條件下的貯存時間可長達一年以上，特別是其在性能上不僅具有與天然血相似的良好的攜、釋氧功能，且其粘度低，粒度小，對微循環周圍組織的供氧能力還超過了天然紅細胞，因而在心腦血管等缺氧性疾病的治療以及緊急救治方面顯示出了良好的發展前景。

雖然為解決以人體的血紅蛋白為原料制備紅細胞代用品中所存在的人血紅蛋白的來源受限問題，有報導以大腸桿菌表達的基因重組人血紅蛋白已經研究成功；也有報導從人血干細胞體外培養誘發出的人紅細胞已在實驗室初步完成，但這些技術在投入工業化生產都尚存在有工藝復雜和成本過高等方面的問題。因此，目前直接以動物血液或人體血液為原料制備血紅蛋白類紅細胞代用品仍是主要采取的途徑和方式。在這些方面，目前資料已有報導的一種方法，是主要通過超濾和用丙烯葡聚糖凝膠柱S-100處理，然后經高壓液相柱層析，最后通過親合層析純化血紅蛋白的方法，可得到高純度的血紅蛋白溶液。但其方法操作工序較繁瑣，導致成本過高，且回收率也較低。還有資料報導采用標準陰離子交換法和陽離子交換法，可使所制備的牛血紅蛋白的純度達到99％。這些方法普遍還存在血紅蛋白的回收率低以及尚不適合于大規模工業化生產的問題。

已有文獻報導，使血紅蛋白處于脫氧狀態能提高其對加熱溫度的耐受性。為此，曾有報導采用過飽和置換層析后，使血紅蛋白與一氧化碳結合，以取代血紅蛋白中所結合的氧，然后經巴氏消毒滅活病毒以及陰離子交換柱層析和陽離子柱層析處理，可得到高純化的血紅蛋白制品。由于血紅蛋白與一氧化碳的結合力比氧約大150倍，因此用一氧化碳驅除和替換血紅蛋白中結合的氧雖較為容易，但處理后使已結合的一氧化碳再與血紅蛋白解離則顯然更為困難。另有資料報導，對經溶血處理得到的粗制溶血液，用通入氮氣、氬氣等無氧惰性氣體或真空的方式，使血紅蛋白中所結合的氧充分施放后，再在加入還原性的谷胱甘肽、二硫蘇糖醇(DTT)或次硫酸類化合物、連二亞硫酸類化合物、亞硫酸氫類化合物、硫氫類化合物等具有還原性的含硫化合物，并在保持脫氧狀態下加熱數小時至數天，以除去其中的非血紅蛋白類的其它蛋白質成分并對病毒進行滅活的制備無基質血紅蛋白的方法。該文獻雖對有關脫氧、加熱及病毒滅活等條件的研究作了說明，但未明確其對所得血紅蛋白的純度及其對制品的有關性能有無影響和/或改變。

發明內容

針對上述情況，本發明將提供一種操作方法和所需設備都大為簡化，且能使制備時間周期縮短，成本降低的用于紅細胞代用品的高純度無熱原無基質血紅蛋白制備方法。該方法制備所得的血紅蛋白制品不僅可達到同樣的高純度與無熱原要求，而且可以有較高的回收率。

本發明的用于紅細胞代用品的高純度無熱原無基質血紅蛋白的制備方法，是在0℃-4℃條件下，在由天然血細胞經溶血處理得到的粗制溶血液中加入抗氧劑并調節溶液pH5.40-6.00后，充分脫除存在于血紅蛋白中的結合氧和溶解氧后，在按與脫氧血紅蛋白溶液重量/體積比為1-2％的量加入多羥基化合物作為保護劑的條件下，于50℃-60℃加熱1-3小時，然后作常規過濾和超濾膜過濾處理并調整pH7.0-7.4。