[發明專利]大蹼鈴蟾鈴蟾肽及其制備方法和其基因

無效

• 申請號: 01108521.5
• 申請日: 2001-06-08
• 公開（公告）號: CN1390851A
• 公開（公告）日: 2003-01-15
• 發明（設計）人: 張云;賴仞;劉衡;李文輝
• 申請（專利權）人: 中國科學院昆明動物研究所
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K1/14;C12N15/11;C07H21/00
• 代理公司: 昆明大百科專利事務所
• 代理人: 楊宏珍

本發明涉及一種大蹼鈴蟾(Bombina?maxima)鈴蟾肽及其制備方法和其基因，屬生物醫學領域。

鈴蟾肽(bombesin)是一類神經內分泌多肽，具有廣泛而復雜的生物學效應，主要包括3方面的生理功能：神經遞質，促激素和有絲分裂原。其最顯著的生理功能是作用于大腦孤束核而引起食欲減退。目前在國際上已經被用于研究和開發減肥藥物。

很多兩棲類動物在中國屬于傳統中藥和民族藥物而被廣泛應用，如中華蟾蜍(Bufo?gargarizans)，大蹼鈴蟾(Bombina?maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana?guentheri)和澤蛙(Euphlyctis?limnocharis)等。這些兩棲類動物的皮膚和內臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效。大蹼鈴蟾主要分布于我國的云南、四川省，是我國的特色資源動物之一，也是特色的民族民間藥物。在國外，兩棲類皮膚特定藥理活性單體化合物的尋找已是新藥發明的熱點。據文獻報道，國外學者已從東方鈴蟾(Bombina?orientalis)中分離出一低分子量具胰蛋白酶抑制活性的多肽BSTI。從蟾蜍和林蛙皮膚中得到的降壓肽類物質bufokinin和ranakinin有舒張血管和降血壓的作用，已在治療心血管疾病方面顯示出誘人的應用前景；最近，一種兩棲類核酸酶對HIV的選擇性抑制作用更引起了人們對兩棲類活性物質的注意。近十幾年對170多種兩棲類皮膚活性肽和類似物進行了篩選，證明有40多種活性肽有較好的藥物開發前景。

發明人將本發明的大蹼鈴蟾鈴蟾肽全序列氨基酸結構經蛋白質數據庫進行搜尋比較，未發現有任何相同多肽，與從歐洲鈴蟾(Bombina?bombina)皮膚中得到的鈴蟾肽有8個氨基酸的差異，發明人將本發明的鈴蟾肽編碼基因經基因數據庫進行搜尋比較，未發現有任何相同基因。

本發明的目的是基于上述現有技術基礎，提供一種用于開發減肥藥物的大蹼鈴蟾鈴蟾肽及其制備方法和其基因。

為了實現本發明的目的，本發明提供了如下技術方案：

大蹼鈴蟾鈴蟾肽，為我們從中國兩棲類動物大蹼鈴蟾(Bombina?maxima)皮膚分泌物中分離得到鈴蟾肽，它由16個氨基酸組成的一種單鏈多肽，分子量1887，等電點10.6，多肽氨基酸全序列一級結構為：焦谷氨酸-賴氨酸-賴氨酸-脯氨酸-脯氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-色氨酸-丙氨酸-纈氨酸-甘氨酸-組氨酸-苯丙氨酸-酰胺化甲硫氨酸(pEKKPPRPPQWAVGHFM-NH₂)。

大蹼鈴蟾鈴蟾肽的制備方法，是將活體大蹼鈴蟾用水清洗干凈，置于帶蓋的玻璃容器中，滴加無水乙醚(1升體積容積加1毫升無水乙醚)，密閉容器3-5分鐘，可見大量的泡沫狀物質從大蹼鈴蟾皮膚分泌出來，收集分泌物，離心(10000rpm，20分鐘)，冷凍干燥后，分子篩凝膠過濾分離，收取所得峰V再經高效液相色譜(HPLC)反相C18柱分離純化，取第二步HPLC反相C18柱層析分離出的峰(箭頭所示)即可。然后用HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用快原子轟擊質譜法(Fast?atom?bombardment?mass?spectrometry，FAB-MS)，等電聚焦電泳測定等電點，N-端氨基酸用焦谷氨酸酶處理后再用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結構。

大蹼鈴蟾鈴蟾肽用于藥物制備的應用。

大蹼鈴蟾鈴蟾肽基因的克隆包括：大蹼鈴蟾皮膚總RNA提取，mRNA純化，mRNA反轉錄及cDNA文庫構建，在歐洲鈴蟾鈴蟾肽信號肽核苷酸序列的基礎上設計引物，利用PCR方法篩選鈴蟾肽基因。根據信號肽序列所設計的擴增引物LR126，其長度為22個核苷酸，其序列為5’ATGTCTGCGATTCCTCTGAACA3’，PCR另一擴增引物為位于克隆插入部分的3’端的載體SP6啟動子引物，其序列為5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’。所獲陽性單克隆進行基因核苷酸序列測定。基因測序結果表明編碼大蹼鈴蟾鈴蟾肽的基因由522個核苷酸組成，其自5’端至3’端序列為：

CTCAGACTCTCACAGCTCTGCGGTACTCACAGCTTTAGACATGTCTGCAATTCCTCTGAA

CAGGATCCTGCCTCTAGGGTTCCTATTTTGCCTGCTTCTTTCCTCCTTCATTTCTCTGTC

CAGCTGCATGGAGTTCGTTGAAGATGCCAACAATCAGGGCAGAATCAGCCTGCAGAAGAA