[發明專利]一種使用免疫PCR技術的紅斑狼瘡抗Sm抗體的檢測方法

無效

• 申請號: 01106288.6
• 申請日: 2001-03-07
• 公開（公告）號: CN1373364A
• 公開（公告）日: 2002-10-09
• 發明（設計）人: 晏舒;曾常茜;尹學念;遲婉莉;李乃奚;欒瑩莉
• 申請（專利權）人: 吉化集團公司總醫院
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/558
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司
• 代理人: 丁洪學

本發明屬于抗體的檢測方法。

系統性紅斑狼瘡(SLE)是常見的自身免疫病。具有累及多臟器，威脅生命，發病率高等特點，但早期治療卻有較高的治愈率或得到有效的控制。

目前診斷SLE的指標有抗dsDNA抗體和抗Sm抗體，抗dsDNA抗體，不僅與SLE的活動有關，而且其他疾病也可以檢出，抗Sm抗體可能是一種回憶性抗體，在SLE非活動期也可以檢出，是SLE的一種標志性抗體，但檢出率低。

現有的抗體Sm抗體檢測方法有Western-blot法，CIE法和ELISA法，前兩種方法敏感性低，且操作復雜費時，臨床應用受到限制，ELISA法特異性強，但敏感性不高。

PCR技術是一種基因檢測技術，其原理是模擬DNA體內復制一種體外核酸擴增過程，這種檢測技術具有快速、靈敏、特異的特點。1992年PCR技術開始在免疫分析中應用，免疫PCR將抗原抗體反應的特異性與PCR擴增結合在一起成為極為敏感的免疫測定技術。

本發明的目的是建立一種用免疫PCR技術檢測紅斑狼瘡抗Sm抗體的方法，以克服現有的抗Sm抗體檢測方法的不足之處。?

本發明的技術方案是利用酶標軟板，在每個孔中加入1∶1000～1∶2000(1000U/ml)稀釋的SmAg100μl在37℃溫度下1～2h，然后用洗滌液洗滌3次，每孔加50μl～200μl封閉液，在25～30℃溫度下封閉30min～1h取出后再用洗滌液洗滌3次，每孔加入100μl血清，37℃溫育40min，取出后再洗滌3次，之后加入1∶1500～1∶2500稀釋的SaHIgG-DNA探針100～200μl，37℃溫育45min，取出，再洗滌3～5次，最后加入PCR反應混合物，覆蓋70μl石蠟油，在PCR擴增儀上進行擴增，擴增條件為，預變性94℃2min再行94℃40sec，55℃40sec，72℃60sec共35個循環，繼續72℃延伸5min，擴增后，取PCR擴增產物20μl加入到2％瓊脂糖凝膠中電泳，經EB染色，在紫外反射透射儀上觀察結果，照相，同時設PCR陽性對照，同上法進行PCR擴增。

使用本發明的積極效果是：敏感性實驗結果表明，免疫PCR方法檢測血清抗Sm抗體的敏感性是ELISA方法的10⁷倍。用免疫PCR方法對抗Sm抗體的檢出率明顯高于ELISA方法(P＜0.05)。用免疫PCR方法檢測血清標本抗Sm抗體結果表明，SLE患者血清Sm抗體陽性率為54.9％，而其它自身免疫病患者血清和正常對照血清未見此抗體。因此，免疫PCR方法檢測血清抗Sm抗體的特異性強。相關性試驗結果表明，免疫PCR方法檢測血清抗Sm抗體與ELISA方法呈高度正相關(P＞0.001)。重復性試驗結果得到批內和批間CV值分別為2.3～4.8％和3.7～6.95％，表明方法穩定、可靠、重復性好。

本發明的實施例：利用40孔酶標軟板，在每個孔中加入1∶1500(1000U/ml)稀釋的SmAg100μl在37℃溫度下1.5h然后用洗滌液洗滌3次，每孔加100μl封閉液，在25℃溫度下封閉45min，取出后再用洗滌液洗滌3次，每孔加入100μl待檢血清37℃溫育40min，取出后再洗滌3次，之后加入1∶2000稀釋的SaHIGg?DNA探針150μl，37℃溫育45min，取出，再洗滌5次，最后加入PCR反應混合物，覆蓋70μl石蠟油，在PCR擴增儀上進行擴增，擴增條件為預變性94℃2min再行94℃40sec，55℃40sec，72℃60sec共35個循環，繼續72℃延伸5min，擴增后取PCR擴增產物20μl加入到2％瓊脂糖凝膠中電泳，經EB染色，在紫外反射透射儀上觀察結果，照相，同時設PCR陽性對照，同上法進行PCR擴增。

本發明所使用的試劑與設備來源是，純化SmAg(1000U/ml)、抗Sm抗體陽性和陰性血清、SaHIgG-DNA探針、Taq?DNA、引物(p21/p23)、瓊脂糖、溴化乙錠(EB)均為市場購買。

本發明試劑需經以下配制。

包被緩沖液(PH9.6?0.1mo/L碳酸鹽緩沖液)：

Na₂CO₃?????????4.244g?

NaHCO₃??????????5.04g

蒸餾水加至???????1000ml

PH7.4?0.02mol/L?PBS：

NaCL?????????????8g