[發(fā)明專利]從轉(zhuǎn)基因抗菌肽蠅蛆中制備人用基因抗菌肽藥品的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 01106190.1
• 申請日: 2001-02-23
• 公開（公告）號: CN1312292A
• 公開（公告）日: 2001-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 茍仕金;茍鴻鷹;王成余
• 申請（專利權(quán)）人: 遼寧天成生物制藥研究所
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;A61K35/64;A61K38/02
• 代理公司: 遼寧專利事務(wù)所
• 代理人: 李叢

本發(fā)明涉及利用轉(zhuǎn)基因蠅蛆提取抗菌肽，特別是從轉(zhuǎn)基因抗菌肽蠅蛆中制備人用基因抗菌肽藥品的方法。

在自然界，蒼蠅是傳播疾病的重要媒介害蟲，最多能給人、畜傳染多種疾病，但自身并不染病。蒼蠅對惡劣環(huán)境具有極強的適應(yīng)能力和有效的防御機制；大量研究證實，任何病菌在蒼蠅體內(nèi)的存活時間最多不超過7天，而只要有萬分這一濃度的蒼蠅抗菌物質(zhì)，就可以殺死多種病菌，其效力是目前人類已發(fā)現(xiàn)的任何一種抗菌素所無法比擬的。在目前不少病原菌對已有抗生素逐漸產(chǎn)生耐藥性，而新的抗生素發(fā)現(xiàn)又極為困難，蒼蠅抗菌肽不乏是未來抗菌素的最佳選擇。

蒼蠅的抗菌肽具有廣譜抗菌活性，可以成為新一代不會在人體內(nèi)形成抗藥性的超級抗生素藥物。美國的馬蓋寧制藥公司于1987年開始致力于Magainin的商業(yè)性研制，現(xiàn)已人們贊譽“馬蓋寧”象青霉素那樣，具有劃時代的應(yīng)用潛力。馬蓋寧(一種蛙皮肽)作為人用藥。2000年批準上市后，當(dāng)年銷售額即達10億美元。

現(xiàn)代研究證實，抗菌肽廣泛存在于動物(昆蟲)，植物和微生物中，采用純化方法難以獲得大量的抗菌肽。我們將人工合成的一種外源性抗菌肽，采用基因工程方法實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因蠅蛆抗菌肽為工廠化生產(chǎn)高含量抗菌肽奠定了堅實基礎(chǔ)。

本發(fā)明的目的是利用現(xiàn)代技術(shù)手段，從轉(zhuǎn)基因抗菌肽蠅蛆中制備人用基因抗菌肽藥品的方法。

從轉(zhuǎn)基因抗菌肽蠅蛆中制備人用基因抗菌肽藥品的方法：_收集蠅蛆→蠅蛆滅菌技術(shù)處理→蠅蛆抗菌肽含量→低溫深凍、貯存原料低溫粉碎制成超微勻漿→抽提去除雜質(zhì)→濃縮→分離純化→鑒定各項指標(biāo)→加穩(wěn)定劑及賦形劑→調(diào)配不同規(guī)格制品→半成品鑒定→成品分裝。

一、轉(zhuǎn)基因抗菌肽家蠅的飼養(yǎng)

轉(zhuǎn)基因抗菌肽蠅蛆接種于已配好的飼料中，飼料配方按麩皮、奶粉、白糖、米粉、豆餅粉等比例配成轉(zhuǎn)基因抗菌肽蠅蛆的飼養(yǎng)。使配料松軟透氣，也可增加酵母粉及蛋白質(zhì)的含量，以利幼蛆蛆的生長與發(fā)育。飼養(yǎng)盒(框)中飼料，厚度以不超過4-5公分為好，接種時用小鏟將孵化盒中所孵化出的一齡幼蛆(種子)鏟出并慢慢放入飼養(yǎng)盒中飼料上，接種量不可過密，也不能過稀。

幼蟲(蛆)飼養(yǎng)盒中吃飼料時，一般是自上而下，若飼養(yǎng)盒中的培養(yǎng)物要注意溫度、溫度和PH值，以及室內(nèi)光線和通氣。要隨時檢查溫度、濕度、PH值，飼料及蠅蛆的密度，隨時調(diào)整。

幼蛆從卵孵化出，體長2毫米，24-36小時幼蛆進行第一次蛻皮，再經(jīng)一次蛻皮民為老熟幼蟲，此時體長可達12-14毫米，整個幼蟲期為5-8天。

成熟的老熟幼蟲(蛆)即停止取食，改變趨向，靜止化蛹。飼養(yǎng)人員可及時給予這樣的環(huán)境使之化蛹保種。同時，大量成蛆(老熟幼蟲)分離出來，加入適量緩沖液利用滲透透壓的壓差，使蠅蛆中抗菌肽游離，同時還用物理學(xué)方法誘導(dǎo)或降低氧氣濃度以進一步提高轉(zhuǎn)基因蠅蛆體內(nèi)抗菌肽的含量。經(jīng)過這樣處理后按一定規(guī)格分裝，低溫冷凍。作產(chǎn)品原料或商品貯存?zhèn)溆谩?/p>

家蠅要在工廠化滅菌條件飼養(yǎng)。以滿足抗菌肽藥品產(chǎn)業(yè)化的需要。

二、從轉(zhuǎn)基因抗菌肽蠅蛆制備藥用抗菌肽的方法

從轉(zhuǎn)基因抗菌肽蠅蛆中制備藥用抗菌肽工藝可人分為轉(zhuǎn)基因抗菌肽蠅蛆原料的貯藏、蠅蛆抗菌肽粗品提取、精品純化、分裝燈檢與包裝。

1、蠅蛆原料要求與貯藏：原料要從工廠化無菌飼養(yǎng)轉(zhuǎn)基因家蠅的蠅蛆，于低溫保存。要有轉(zhuǎn)基因抗菌肽蠅蛆、重金屬和相關(guān)衛(wèi)生指標(biāo)的檢定報告。

2、粗品提取：冷凍的轉(zhuǎn)基因抗菌肽蠅蛆用絞肉機絞碎，再用膠體磨研磨制成勻漿，倒入大罐內(nèi)，按勻漿量1∶1加入蒸餾水置入加層升溫鍋，使溫度加熱至100度，持續(xù)20分鐘，用輸液泵把藥液輸入濾槽內(nèi)進行過濾，再將藥液放入水槽冷卻，微孔濾膜過濾除去殘渣，藥液為抗菌肽粗品，置于2-8度保存。

3、精制純品：取微孔濾膜除去殘渣的抗菌肽藥液再用5000分子量超濾膜超濾除5000以上大分子，然后用3000分子量超濾膜除3000以下小分子，濃縮最后過層析柱，分離得到的半成品原液其抗菌肽純度達98％，也可將加熱升溫后的勻漿，用大容量低溫離心收集上清液，將上清液加入硫酸銨沉淀，離心分離收集沉淀，然后在沉淀中加入緩沖液溶解，離心分離收集上清液，上清液經(jīng)G-25脫鹽、DEAE離子交換柱、phenyl疏水層析過柱、S-100凝膠層析柱分離得到合格的半成品原液，純度也可達98％。

4、分裝、燈檢及包裝

將檢定合格的半成品原液加入賦型劑以及保護劑按生產(chǎn)所需規(guī)格稀釋，稀釋液經(jīng)過筒式過濾器除菌，經(jīng)過熱源質(zhì)、無菌試驗合格后，經(jīng)過分裝機裝入西立瓶，進行軋蓋、燈檢。抽樣做成品檢定，經(jīng)過成品檢定合格后可包裝入庫。