[發(fā)明專利]簡單快速的mRNA層析芯片檢測技術

無效

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• 申請日: 2001-04-13
• 公開（公告）號: CN1381589A
• 公開（公告）日: 2002-11-27
• 發(fā)明（設計）人: 繆金明
• 申請（專利權）人: 繆金明
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及一種簡單快速mRNA層析檢測芯片的檢測技術，具體地說指游離mRNA在層析遷移過程中被固定的cDNA探針俘獲并被原位顯色的檢測方法，包括膜條探針陣列制作、RNA快速提取、層析雜交和信號分析等。該技術簡單快速、可靠，可用于基因表達譜的實驗室研究和臨床診斷。

隨著人類基因組計劃的進展，全部DNA序列的排序已被基本破譯。結構基因組學產(chǎn)生的巨量數(shù)據(jù)正在被有效的利用，功能基因組學面臨一個富有挑戰(zhàn)性的大發(fā)展階段，基因組學還是蛋白組學都強調(diào)從器官組織的整體水平上對基因的活動規(guī)律進行研究，即對mRNA或蛋白產(chǎn)物進行規(guī)模化研究，通過基因活動的差別和其產(chǎn)物之間的相互作用了解某范圍內(nèi)的生命活動規(guī)律。從而加速了解碼生命的進程。其中常用的方法有2-D電泳結合質(zhì)譜分析的方法，另一種極有前途的方法就是DNA芯片，DNA芯片是一種集微型化，并行化，比較研究于一體的研究手段。

DNA芯片技術于1995年正式問世，是一種高度集成的DNA檢測技術。首先采用專用自動化設備將幾個、幾十、幾千甚至幾萬個已知DNA寡核苷酸探針或全序列基因探針排列在玻片、硅片或膜質(zhì)材料上，然后將待檢測樣本中的所有DNA成分與芯片探針雜交，有相對應的靶DNA就會出現(xiàn)相應的雜交信號。理論上可以做到一次實驗檢測細胞或組織內(nèi)所有基因或可以表達的基因。因此這種技術對胚胎發(fā)育控制的研究、疾病發(fā)生發(fā)展的研究、以及生理病理的研究提供了最佳的研究手段。主要用途有：

1)基因表達差異的研究：用數(shù)千甚至數(shù)萬個cDNA/mRNA片段點樣或固定于玻璃或硅芯

??片上，通過對特定條件下(發(fā)育，生長，外界因素等)組織中的mRNA進行隨機性雜交，

??通過分析軟件對結果進行分析，進而分析特定組織的基因表達譜。

2)基因藥物的篩選：通過分子設計或模擬將大量由組合化學法產(chǎn)生的隨機藥物分子和

??組織中的多基因進行隨機作用篩選有特異結合作用的藥物分子，為藥物基因組學的一

??種新型有效方法。

3)臨床診斷及預后檢測：用含多種病原微生物基因或致病基因的芯片可同時進行多樣

??本檢測，大大提高了檢測效果。

4)環(huán)境生物學檢測：自然環(huán)境中的許多化學物質(zhì)對人類及其它生物的生存造成影響。例

??如，用DNA芯片方法可同時檢測人類各種復雜疾病(哮喘，糖尿病，高血壓等)的遺

??傳易感性因素。

5)蛋白質(zhì)芯片：以蛋白為探針固定在固體支撐物表面，形成蛋白質(zhì)芯片，可用于檢測蛋

??白之間的相互作用，而不會互相影響活性。

用于檢測mRNA表達狀態(tài)的DNA芯片一般以cDNA全部或部分序列作為探針固定于芯片表面，cDNA探針的數(shù)目依目的而定，一般可選擇幾十至幾千，檢測技術以核酸雜交為基本原理，檢測時先抽提RNA或mRNA，純化后的RNA再進行逆轉(zhuǎn)錄并同時標記熒光素，然后把標記的靶序列與芯片上的大量cDNA探針進行雜交，最終通過掃描獲得最佳的雜交信號，由計算機收集熒光信號，并對每個點的熒光強度數(shù)字化后進行分析。

但是這類高集成度cDNA芯片技術，還存在以下缺陷和不足：

1.需要專用的檢測設備

現(xiàn)有芯片技術都是采用高敏感性的熒光標記技術標記被檢測的靶DNA分子，因此芯片的檢測就需要昂貴的專用芯片激光掃描儀。

2.檢測程序復雜，檢測耗時太長

現(xiàn)有DNA芯片檢測技術只是將DNA探針集成固定進行逆向雜交而已，與傳統(tǒng)的雜交技術相比，檢測程序仍然復雜，需要經(jīng)過培訓的專業(yè)技術人員操作，一般至少需要2天的時間才能完成。而臨床診斷項目的要求首先是快速和操作簡便，一般性檢查最好能在1～2小時內(nèi)完成并出具報告。

3.檢測成本高

由于芯片的制作程序復雜，一般需要采用特殊修飾的玻片，需要特殊點樣設備和檢測設備，同時由于PCR及標記的試劑昂貴，增加的檢測成本致使芯片的成本居高不下。并且同時檢測幾百幾千個功能上并不相關的基因并不是臨床所需要的，臨床上需要的是具有特殊針對型并能解決實際問題的檢測項目，比如，了解腫瘤基因的表達情況、了解地中海貧血的珠蛋白基因的所有可能突變位點的狀況等等。

4.需要特定的無核酸酶環(huán)境

在進行RNA操作時需要特殊的無核酸酶的環(huán)境，對操作人員要求較高，甚至要求專職的檢測人員，因為RNA對環(huán)境中污染的核酸酶非常敏感，操作稍有不慎，便影響檢測的結果。

本發(fā)明的目的是提供一種檢測程序較簡單，可快速進行mRNA檢測的芯片方法。