[發明專利]用于轉基因植物中生產類胡蘿卜素的相關基因的合成

無效

• 申請號: 01105878.1
• 申請日: 2001-04-06
• 公開（公告）號: CN1380415A
• 公開（公告）日: 2002-11-20
• 發明（設計）人: 姚泉洪;彭日荷;熊愛生
• 申請（專利權）人: 上海永業農科生物工程有限公司;上海市農業科學院生物技術研究中心
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/63;C12N15/70;C12P23/00;C07C403/24;A01H1/00
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司
• 代理人: 費開逵

本發明涉及植物基因工程領域中的植物生物反應器，更具體地說是通過化學合成的方法合成能在植物體內生產類胡蘿卜素的6個相關基因。

類胡蘿卜素是重要的天然色素，廣泛存在動物和植物體內，自目前為止有600多種類胡蘿卜素被發現，其顏色從黃色至橙紅色，長期用來修飾食品的顏色。隨著對類胡蘿卜素化學結構的了解，類胡蘿卜素的功能逐漸被挖掘。

類胡蘿卜素具有抗氧化功能。在類胡蘿卜素化學結構中有9-11個共軛雙鍵，能夠與自由基結合。避免細胞的氧化損害累積到一定程度后造成細胞老化甚至死亡。類胡蘿卜素具有抗癌變作用。在研究蝦青素等類胡蘿卜素對黃曲霉毒素引發肝癌的影響中發現，類胡蘿卜素可以降低肝癌病灶的數目和大小。類胡蘿卜素具有增強機體免疫作用。蝦青素等類胡蘿卜素能夠刺激抗體的產生(劉子貽，1997，中國海洋藥物)。

類胡蘿卜素眾多功能的發現，大大增加了市場上對該類化合物的需求。僅蝦青素一種，每年的需求額即超過一億美元(梁世中，2000，食品與發酵工業)。目前大部分類胡蘿卜素化合物是通過化學合成獲得，需要很高的成本和資源(Johnson?EA，1995，Adv?Biochem?Eng?Biotechnol)。通過大面積培養杜氏耐鹽藻生物也可獲得大量的類胡蘿卜素，但是這種藻類只能在干旱的地區養殖，對水質、環境及光的要求很高(鄭曉東，2000，浙江大學學報)。蝦青素等類胡蘿卜素化合物還可以直接從甲科類動物中提取，但是含量很低，不適合大量生產(中國飼料行業信息網)。利用微生物生產蝦青素等類胡蘿卜素化合物成了近些年研究的重點，其中以紅法夫酵母菌研究最多，該菌具有作為色素生物來源的一些必要特征：快速異氧代謝，培養時間短，能夠在發酵罐中實現高密度發酵。雖然這類微生物具有很大的開發潛力，但目前普遍存在產量低的缺陷，還未能進行大規模的商業化生產(王菊芳，2000，生物工程進展)。

利用基因工程技術，將合成蝦青素等類胡蘿卜素的關鍵酶基因克隆并改造，利用合適的啟動子進行調控，將這些基因同時轉化到細菌、酵母以及植物中，實現蝦青素等類胡蘿卜素化合物的高效表達，將能滿足迅速發展的市場對這些產品的巨大需求。其中以培育能大量生產β-胡蘿卜素和蝦青素的植物更具社會價值和市場價值。以水稻、甘藍和油菜等作物作為材料生產的金色水稻、金色甘藍和金色油菜，將成為人類健康的風景線。

從糖酵解產物乙酰輔酶A開始合成β-胡蘿卜素需要一系列酶催化。大多數生物要經過乙酰輔酶A到法呢基焦磷酸(FPP)階段，FPP在不同的酶作用下，合成麥角固醇或β-胡蘿卜素。從FPP到β-胡蘿卜素需要四種酶參與。法呢基焦磷酸(FPP)在垅牛兒基垅牛兒基焦磷酸合成酶(CrtE)催化下合成垅牛兒基垅牛兒基焦磷酸(GGPP)，GGPP在八氫番茄紅素合成酶(CrtB)作用下產生八氫番茄紅素，之后在八氫番茄紅素去飽和酶(CrtI)作用下逐漸形成番茄紅素，最后在番茄紅素β環化酶(CrtY)催化下，番茄紅素合成β-胡蘿卜素。蝦青素是β-胡蘿卜素合成的終止點，由β-胡蘿卜素轉變為蝦青素需要加上兩個酮基和羥基，體外合成比較困難。但是在生物體內只需在兩個酶的催化下即能由β-胡蘿卜素合成蝦青素。β-胡蘿卜素羥化酶(CrtZ)和β-胡蘿卜素酮酶(CrtW)能夠在β-胡蘿卜素的C3/C3’和C4/C4’位置上加上羥基和酮基，形成蝦青素(Claudia?SD，2000，EnviromentalBiotechnology)。

至目前為止，分別從細菌、植物、藻類和真菌中克隆了近150個與類胡蘿卜素合成有關的基因(Hirschberg?J，1997，Purelity?Applied?Chemical)。這些功能相近的基因在核苷酸水平上差異很大。一方面，這些基因能夠根據功能組合在一起，轉化到不同的微生物或植物中，生產出各種各樣的類胡蘿卜素產品(Misawa?N，1998，Applied?and?Environmental?Microbiology)。另一方面，基因的差異給植物生產類胡蘿卜素產品提供了保證，外源基因的轉化不能改變植物中同功能基因的功能，造成基因沉默現象，相反能夠加強類似基因的功能，提高產品的產量(Hirschberg?J，2000，Nature?Biotechnology)。