[發明專利]乙肝病毒前S1抗體酶免測定試劑盒及制備方法

有效

• 申請號: 01105293.7
• 申請日: 2001-02-01
• 公開（公告）號: CN1368638A
• 公開（公告）日: 2002-09-11
• 發明（設計）人: 杜鳳鳴
• 申請（專利權）人: 上海新新醫學生物工程公司;杜鳳鳴
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/531;G01N33/576
• 代理公司: 上海新天專利代理有限公司
• 代理人: 王巍

1、一種乙肝病毒前S₁抗體酶免測定試劑盒，其特征在于該試劑盒是由預包被反應條，酶結合物工作液、陽性對照物、陰性對照物、樣品稀釋液、濃洗滌液、顯色劑A、顯色劑B和終止液組成的。

2、一如權利要求1所述的一種乙肝病毒前S₁抗體酶免測定試劑盒的制備，其特征在于該方法是：(一)基因工程前S1抗原的制備(1)前S1?DNA序列?1???????10?????????20???????30????????40????????50???????60?MGGWSSKPRKEMGTMLSYPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPVKDDWPAANQVGVGA

??70?????????80????????90??????????100???????110?FGPRLTPPNGGILGWSPQAQGILTTVSTIPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQA(2)材料：HBV由軍科院五年四室提供，PCRKit、限制性內切酶，T4DNA連接酶購自上海華美公司，GST，還原型4B購自Sigma公司，上海基康公司合成上游引物5′-CGGATC-CATGGGAGGTTGGTCTTCCA，下游引物5′-GC-GATTTCCTAGTGGAATGTTGTGGAGT，(3)方法：反應在Progene公司PCR合成儀上進行，反應條件為94℃30s，60C?30s，72℃?30s，35個循環，PCR產物由基康公司測序，(4)表達和純化：將PCR產物用BamH?I和EcoR?I酶切，在1％瓊脂糖凝膠上電泳回收387bp的片段，與相同酶切的載體pGEX-4T-1連接，轉化大腸桿菌HB101株，誘導用IPTG，終濃度1mmol/L，SDS-PAGE分析結果，按Sepharose?4B說明書純化表達融合蛋白產物，采用間接ELISA法檢測前S1抗體，(二)SPA-HRP的制備(1)稱5mg辣根過氧化物酶(HRP)加0.5ml蒸餾水，再加0.5ml?60mM過碘酸鈉氧化15′4℃中，(2)加0.16M乙二醇0.5ml中止氧化4℃?30′(3)加10mg/ml純SPA0.5ml，裝袋對碳酸鈉緩沖液過夜，(4)取出袋內液體，加5mg/ml硼氫化鉀0.2ml，4℃3h再裝透析袋對PH7.2?0.01M?PBS透析24h換液4-5次，(5)取出SPA-HRP作活性和效價測定(三)陰性對照血清配(1)用本試劑盒檢測正常人血清30份，混合A450＜0.1的血清，(2)上述混合血清加等量小牛血清后再檢測一次，確定A450＜0.1，(3)混合血清中加2/萬疊氮鈉，過濾分裝-20℃中保存，(四)陽性對照血清配制(1)取兔抗前S1抗血清作ELISA前S1抗體效價測定；取A450＞2.0的滴定效價的2倍濃度為陽性對照血清，(2)取該濃度抗血清加等量小牛血清再做ELISA測定A450＞1.5(3)上述陽性血清中加2/萬疊氮鈉，過濾分裝，-20℃中保存，(五)底物緩沖液配制1、甲液(1)各稱磷酸氫二鈉18.4克，檸檬酸5克，PM50mg，放入容量瓶中加雙蒸水至1000ml，攪拌溶解后再加30％雙氧水400ul，(2)過濾除菌后分裝小瓶2、乙液(1)稱EDTA?150mg加入1000ml雙蒸水中，加熱溶解，(2)上液冷卻后加檸檬酸1.05克，再加用二甲亞砜溶解的TMB250mg，(3)分裝入黑色小瓶中，(六)本發明乙肝病毒preS1抗體酶聯免疫測定方法的建立，(1)用20mM?Tris-Hcl液將純前S1抗原稀釋為5ug/ml濃度，各反應孔中加0.1ml，置4℃中24h，棄去上清液，拍干，(2)在試管中將待檢血清用蒸餾水(或生理鹽水)作1∶25稀釋，(3)各孔中滴加1滴樣品稀釋液，然后分別加1∶25稀釋的待檢血清50ul，同時做陽性對照孔和陰性對照孔，(4)置37℃溫箱中反應25分鐘后，甩去孔內液體先在草紙上拍2-3下，然后用洗滌液洗5次，每次條孔加滿洗滌液后停留30秒種，每次甩去孔中液體后都要在草紙上拍干，以便徹底洗滌，(5)各孔加2ug/mlSPA-HRP結合物50ul，37℃反應25分鐘，(6)同上徹底洗滌拍干，(7)各孔滴加底物緩沖液甲、乙各1滴，置37℃中反應5分鐘，再每孔滴加終止液1滴，測A450值，(8)結果判定

陰性對照A值×2.5＝臨界值，凡待檢標本孔A值＞臨界值即為陽性，陰性對照小于0.05時按0.05計算，(七)靈敏度，特異性和精密度試驗，1、靈敏度測定(1)陽性血清濃度的定值

在檢測前S1抗原實驗操作中，能中和1ng/ml前S1抗原最高稀釋度血清的抗體定為1u/ml，實際操作時將前S1抗原配成20ng/ml濃度，(2)靈敏度實驗

將上述實驗中滴定為1280u/ml，160u/ml和40u/ml的3份陽性血清用樣品稀釋液作不同濃度稀釋后，按實驗操作方法作靈敏度測定，結果如下：

???????????????????血清抗體效價(u/ml)

血清

??????1280??640???320???160???80????40????20????10

1號???＞2^*?1.65??1.46??0.98??0.74??0.40??0.24??0.17

2號???????????????1.15??0.70??0.46??0.27??0.15??0.06

3號?????????????????????????????????0.45??0.27??0.10

^*A450

測定陰性血清6份，A450分別為0.14，0.06，0.11，0.07，0.07，0.08，陰性平均A450＝0.088，陽性臨界值＝0.088×2.5＝0.22，則本檢測方法對3份陽性血清的檢測靈敏度分別為20u/ml，40u/ml和20u/ml平均為26.7u/ml，2、特異性測定

對用上海長征醫學科學有限公司生產的乙肝二對半試劑盒檢測五項指標全部陰性的血清共30份，按本實驗方法前S1抗體測定，結果如下：??1????2????3????4????5????6????7????8????9????10???11???121?0.06?0.05?0.06?0.05?0.08?0.07?0.10?0.05?0.04?0.11?0.09?0.072?0.10?0.12?0.10?0.07?0.18?0.11?0.13?0.07?0.06?0.10?0.12?0.143?0.12?0.10?0.13?0.09?0.08?0.07

同時用6份小牛血清按實驗操作方法測定的A值分別為0.05，0.05，0.08，0.07，0.06，0.09，平均值為0.067，臨界值＝0.067×2.5＝0.168，則30份血清中有1份血清為可疑陽性，特異性＝29/30＝96.7％，3、精密度測定

取實驗吸光度分別為高中低A值的3份陽性血清做精密度試驗，批內試驗為每份血清同時做12個復孔，批間試驗為每份血清間隔2-3天實驗1次，共測定6次，結果如下：

批內試驗：???1????2????3????4????5????6????7????8????9????10???11???12???X???S??????CV(％)1?1.42?1.37?1.40?1.35?1.37?1.45?1.32?1.40?1.32?1.48?1.30?1.27?1.37?0.0625?4.62?0.74?0.86?0.70?0.81?0.83?0.80?0.72?0.82?0.70?0.85?0.82?0.84?0.79?0.059??7.53?0.26?0.25?0.31?0.27?0.24?0.32?0.25?0.26?0.25?0.25?0.28?0.29?0.27?0.0257?9.5

平均批內CV＝7.2％

批間試驗?

??1????2????3????4????5????6????X????S??????CV(％)

1?1.45?1.30?1.41?1.38?1.28?1.29?1.35??0.071??5.3

2?0.72?0.86?0.70?0.75?0.84?0.77?0.773?0.0644?8.3

3?0.26?0.21?0.31?0.25?0.28?0.26?0.262?0.033??12.7

平均批間CV＝8.77％。