[發明專利]核酸網狀分枝擴增技術

無效

• 申請號: 01104108.0
• 申請日: 2001-02-20
• 公開（公告）號: CN1317576A
• 公開（公告）日: 2001-10-17
• 發明（設計）人: 張永
• 申請（專利權）人: 張小麗;張永;劉宣力
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

權力要求：一種用于檢測樣品中靶核酸的技術方法，即核酸網狀分枝擴增技術。

1、A．這種檢測靶核酸方法，是利用寡聚核甘酸的探針，通過其本身的互補序列與樣品中的核酸進行雜交。這種寡聚核甘酸探針是由一個或多個捕獲探針、擴增探針組成。此捕獲探針的3’端不與靶核酸相互補，而5’端則能與靶核酸互補和雜交。反之，如3’端與靶核酸互補和雜交，則5’端不能為之。此捕獲探針具有與配體相結合的分子，而這個分子安固于支持物上。(見圖1)

擴增探針的3’端和5’端能與靶核酸互補及雜交，而3’端和5’端之間的核酸序列不能與靶核酸結合，由靶核酸，捕獲探針，擴增探針所組成的復合體，通過其捕獲探針的配體與支持物結合。

此復合物可反復沖洗，以去除樣品雜質。

B、將擴增探針3’端和5’端首尾相互連接形成一個環形分子。

C、網狀分枝擴增由以下步驟實現：

引物與環狀擴增探針上的連接區相結合，并由DNA聚合酶沿環狀擴增探針延伸，產生多個重復性單位，多個反向引物與單鏈DNA相結合，并可被DNA多聚酶延伸引物延伸后，使其下游的引物及其延伸的DNA與模板DNA分離。而分離的單鏈可作為正向引物的模板，此過程為網狀分枝擴增。

D、此過程循環往復，直至所有單鏈DNA都變成雙鏈DNA。

E、檢測擴增產物時，如有產物DNA的出現，表明樣品中有靶核酸存在。(見圖2)

2、在權力要求1所述的方法中，配體是由生物素、抗原、半抗原、抗體以及重金屬衍生物和多聚核甘酸組成。這個配體的連接部分是由鏈霉抗生物素蛋白，生物素蛋白，抗體、抗原，以及硫基物和多聚核甘酸組成。

3、在權力要求1中，引物數量可多于2個以上。

4、檢測單一細胞中靶核酸的技術方法：網狀雜交擴增技術。

A、將細胞包藏于細胞基質中。

B、環形探針的3’端和5’端可與細胞內靶核酸相互補并雜交。3’端和5’端之間的被標記的非互補區域有配體連結，如此形成一個復合物。(見圖3)

C、當環形探針的3’端和5’端首尾相連，則構成一個環形分子。

D、加入一個與配體相連接的分子后，此分子與環狀分子上的配體相結合，同時加入信號探針，與連結分子相結合，形成一個帶有信號標記的復合物。

E、沖洗帶有信號標記的復合物。如在細胞檢測中發現信號標記，即證明細胞內存在有靶核酸。

5、A、檢測樣品中的核酸方法。網狀分枝擴增技術，是由寡聚核甘酸探針通過其本身的互補序列與樣品中的核酸進行雜交。寡聚核甘酸探針是由一個或多個捕獲探針組成，在此反應中過程中，靶核酸能與捕獲探針的3’或5’端中任一端相互補雜交。

B、擴增環形探針的3’游離端與5’游離端之間的間隔存在，使得靶核酸能被整合其中，而進一步拷貝，擴增樣品核酸。(見圖4)

C、加入DNA聚合酶，此酶由3’端向5’端引伸，加入連結物，使3’和5’末端首尾相連。

6、檢測樣品中靶核酸的技術方法：環狀擴增技術。

A、在檢測試管中，有一個或多個捕獲探針存在，其捕獲探針的3’端不與靶核酸互補，但5’端能與靶核酸順序互補和雜交。反之，當捕獲探針的3’端與靶核酸順序互補和雜交時，則5’端不與其互補。

B、分離靶核酸，環狀擴增探針和捕獲探針的復合物。

C、把擴增探針3’端和5’端首尾相連接成一個環形分子。

D、環狀擴增探針由以下步驟實現：

正向引物與環狀探針區域相結合，并經由DNA多聚酶沿環狀探針延長，產生多個可重復的單鏈DNA，這一過程即環狀擴增。(見圖5)

E、檢測到單鏈DNA存在，則表明樣品中有靶核酸存在。

7、一種檢測樣品中蛋白的技術方法——網狀雜交擴增技術：

A、一種蛋白(抗原或抗體)有配體附著，通過連接物與信號探針相連接，形成一個帶有信號標記的復合物。

B、沖洗帶有信號標記的復合物。

C、檢測到信號標記，即表明有被檢測蛋白的存在。被檢測蛋白可是抗原、抗體或者為氨基酸(見圖6)

8、檢測樣品中核酸的技術方法；瑩光探針技術。

A、在檢測試管中，加入瑩光探針，此瑩光探針是由兩個單鏈寡聚核酸探針組成，并通過其本身的互補序列相互雜交。長鏈探針的3’端，通過其互補序列與擴增環形探針上的連接區相結合。長鏈探針的5’端攜帶有一個瑩光分子(如FITC)，而短鏈探針的3’端具有一個瑩光吸收分子(如DABCYL)。長短兩鏈相互雜交形成雙鏈的瑩光探針，5’端瑩光分子的能量可傳遞給3’端的吸收分子，因此沒有瑩光顯示。

B、在網狀分枝擴增或環狀擴增反應中加入此瑩光探針。長鏈探針與環形探針的連接區相互補雜交。DNA聚合酶由3’端延伸并盡而形成多個重復單鏈DNA。

C、反向引物與此重復的單鏈DNA相互補雜交后，在DNA多聚酶作用下，由3’端向5’端延伸，并使其與之結合的短鏈探針被分離掉，而長鏈探針上的瑩光能量因沒有被短鏈探針上的吸收分子所吸收，因此，有瑩光發出。

D、檢測到樣品中瑩光信號，即表明樣品中有靶核酸存在。(見圖7)