[發明專利]將二倍體轉變成單倍體用于遺傳診斷

無效

• 申請號: 00814879.1
• 申請日: 2000-10-06
• 公開（公告）號: CN1384887A
• 公開（公告）日: 2002-12-11
• 發明（設計）人: B·沃戈爾斯滕;K·W·金澤勒;H·炎;N·派帕多普勒斯
• 申請（專利權）人: 約翰斯霍普金斯大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/06;C12N5/16;C12N5/26
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 唐偉杰

本發明得到了美國政府基金的資助，即NIH撥款CA43460、CA57345、CA62924、CA67409、CA72851。因此，美國政府保留對本發明的某些權利。本申請要求1999年10月8日提交的臨時申請流水號60/158,160的收益，而且是1999年12月15提交的專利申請流水號09/461,047的部分繼續申請。

????????????????????發明背景

至少就遺傳診斷而言，人類和其它哺乳動物的問題在于它們是二倍體。一個等位基因中的突變(諸如負責所有顯性遺傳綜合癥的突變)總是伴隨著第二個等位基因的野生型序列。雖然在過去的十年里已經開發了用于遺傳診斷的許多有力技術，但是它們都受到模板中存在的二倍性的限制。例如，與突變型條帶具有相同電泳遷移率的野生型條帶能夠使測序梯的解釋變得復雜，尤其是在突變型條帶的亮度較弱的時候。DNA區段的刪除甚至更成問題，因為在這種情況中只有野生型等位基因通過標準技術得到了擴增和分析。這些問題呈現了診斷單基因疾病的困難，而對多基因疾病甚至更成問題，其中作為原因的突變可發生于幾種不同基因之任一種。這種多基因機制是常見易感性綜合癥的規則而非例外，諸如與乳腺癌和結腸癌、失明、以及血液學、神經學、和心血管疾病有關的綜合癥。遺傳診斷這些疾病的靈敏度目前不是最佳的，其中30％-70％的情況難于遺傳分析。

本領域需要簡單的分離和分析來自人類和其它哺乳動物細胞的單個等位基因。

???????????????????????發明概述

本發明的一個目的是提供用于檢測人類或其它哺乳動物染色體上目的基因中的突變的方法。

本發明的另一個目的是提供用于使待測細胞適用于靈敏的遺傳測試的方法。

本發明的還有一個目的是提供可用于遺傳分析的融合雜交細胞群體。

下文所述一個或多個實施方案提供了本發明的這些和其它目的。在一個實施方案中，提供了用于檢測人類或其它哺乳動物目的基因中的突變的方法。使人類或其它哺乳動物的細胞融合嚙齒類細胞受者，以形成人類-嚙齒類或其它哺乳動物-嚙齒類雜交細胞。通過選擇嚙齒類染色體所含第一種標記和第一人類或其它哺乳動物染色體所含第二種標記來選擇融合后雜交細胞，以形成融合后雜交細胞群體。在融合后雜交細胞群體中檢測對于第二人類或其它哺乳動物染色體而言是單倍體的雜交細胞亞群。該第二人類或其它哺乳動物染色體與第一人類或其它哺乳動物染色體是不同的而且沒有選擇。測試雜交細胞亞群以檢測基因、所述基因的mRNA產物、或所述基因的蛋白質產物。該基因位于第二種人類或其它哺乳動物染色體上。mRNA或蛋白質產物的量減少或者基因、mRNA、或蛋白質產物的特性改變指示人類或其它哺乳動物的該基因中存在突變。

依照另一個實施方案，公開了為遺傳測試提供待測細胞的方法。待測細胞對于人類或其它哺乳動物基因而言是單倍體。使人類或其它哺乳動物的細胞融合經轉化的二倍體嚙齒類細胞受者，以形成人類-嚙齒類或其它哺乳動物-嚙齒類雜交細胞。通過選擇第一人類或其它哺乳動物染色體和嚙齒類染色體各自的標記來選擇融合后雜交細胞，以形成在沒有選擇人類或其它哺乳動物染色體的情況中穩定維持一或多個人類或其它哺乳動物染色體的細胞群體。在細胞群體中檢測對于第二人類或其它哺乳動物染色體而言是單倍體的細胞，該第二人類或其它哺乳動物染色體不同于該第一人類或其它哺乳動物染色體，而且沒有選擇。

本發明還提供了嚙齒類-人類或嚙齒類-其它哺乳動物雜交細胞群體，其中，在100個細胞中至少有1個細胞，在其中至少2個人類或其它哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。

本發明由此通過提供對于一種或多種目的基因而言是單倍體的雜交細胞用于分析而為本領域提供了可用于提高多種診斷和分析方法的靈敏度和效力的方法。雜交細胞的人類或其它哺乳動物染色體成分是穩定的且一致的。

????????????????????圖的簡述

圖1：用于生成雜交細胞的策略。使受者小鼠細胞系E2融合人類淋巴細胞，隨后用HAT+遺傳霉素(分別殺死未融合的E2細胞和淋巴細胞)選擇克隆。所有克隆包含負責在HAT中生長的人類X染色體。測定克隆的基因型以確定保留了哪個人類染色體。標有“A”和“B”的染色體表示代表性人類染色體的兩種同系物。圖中指出了所分析6種染色體同系物的二者皆未保留、二者都保留、或保留二者任一的克隆所占平均比例(見正文)。對保留待測基因的一個等位基因的克隆的核酸進行突變分析。