[發明專利]突變型Tn5轉座酶及其使用方法

無效

• 申請號: 00811220.7
• 申請日: 2000-08-02
• 公開（公告）號: CN1367840A
• 公開（公告）日: 2002-09-04
• 發明（設計）人: W·S·列茲尼科夫;T·A·瑙曼
• 申請（專利權）人: 威斯康星校友研究基金會
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/10;C12N9/22
• 代理公司: 上海專利商標事務所
• 代理人: 徐迅

與相關申請的相互參照：

本申請要求享有1999年8月2日遞交的美國臨時專利申請No.60/146,686的優先權，本文將其全部納入作為參考。

關于聯邦政府贊助的研究或開發的聲明

本發明的完成使用了聯邦政府的資金NIH，Grant?No.GM?50692。因此聯邦政府享有本發明的某些權利。

發明背景

通過維持低的移動水平，細菌轉座子如Tn5在細胞內進化。當需要該轉座子來存活時，這種低的移動水平就阻礙了研究者對分子轉座過程的詳盡了解和對轉座過程用途(如開發新型診斷和治療的藥源)的開發。Tn5是IS4家族的保守性“剪貼”轉座子(Rezsohazy，R.，Hallet，B.，Delcour，J.，和Mahillon，J，“插入序列的IS4家族：保守性轉座酶基序的證據”，Mol?Microbiol.9：1283-1295(1993))，其編碼負責它移動的一種53kD轉座酶蛋白質(Tnp)。野生型Tn5轉座酶的氨基酸和核酸的序列是已知的。Ahmed，A.和Podemski，L.“T5的修正序列”Gene154(1)，129-130(1995)，本文將其全部納入作為參考。本文附有編碼野生型Tn5轉座酶的核酸序列，即SEQ?ID?NO：1。還附有SEQ?ID?NO：1編碼的相應于野生型Tn5轉座酶的多肽序列，即SEQ?ID?NO：2。

Tnp蛋白質促進了該整個元件的移動是通過先與兩個19bp特異性結合序列(稱為外末端)(OE；SEQ?ID?NO：3)之一結合，然后形成核蛋白結構(稱為突觸)，各端平頭切割，與靶DNA相連，以及隨后的鏈轉移(Reznikoff，W.S.，Bhasin，A.，Davies，D.R.，Goryshin，I.Y.，Mahnke，L.A.，Naumann，T.，Rayment，I.，Steiniger-White，M，和Twining，S.S.，“Tn5：轉座的分子窗口”，Biochem.Biophys.Res.Commun.266：729-34(1999))。Tn5轉座酶通過聯用OE和內末端(IE；SEQ?ID?NO：4)序列，還可以促進單個插入序列的移動。IE的長度也是19bp，與OE在19個位置中有12個相同(圖1)。體內，Tn5轉座酶表現出對大腸桿菌的OE明顯偏愛。通過存在2個dam甲基化位點(GATC回文序列)，即在每個內末端序列加入4個甲基(IE^ME；也如SEQ?ID?NO：4所示，未顯示甲基化)，抑制了大腸桿菌內轉座酶的識別和與IE的結合(Yin，J.C.P.Krebs，M.P.，和Reznikoff，W.S.，“dam甲基化對Tn5轉座的影響”，J.Mol.Biol.，199：35-45(1988)，本文將其全部納入作為參考)。這種甲基化通過減少蛋白質-DAN最初的識別，降低了轉座(Jilk，R.A.，York，D.，和Reznikoff，W.S.，“轉座酶Tn5外末端的組成”，J.Bacteriol.178：1671-1679(1996))。

要了解Tn5如何轉座的主要障礙是純化的野生型Tnp在體外沒有可檢測得到的活性。最近，開發了一種轉座酶的雙突變高活性形式(“Tnp?EK/LP”)，其能促進體外轉座反應的所有步驟。Tnp?EK/LP蛋白質與野生型Tn5?Tnp的不同之處在于54位(Glu突變為Lys)和372位(Leu突變為Pro)，另外在56位的非本質但有益的變化防止了所謂抑制蛋白的產生。這種修飾的高活性Tnp蛋白質保留了對野生型Tn5轉座酶OE端(或類OE)的明顯偏愛。Tnp?EK/LP澄清了先前體內未充分探究的Tn5轉座的許多方面問題。

體外，多核苷酸轉座是一種將隨機突變或靶突變引入基因組的強有效工具。美國專利No.5,925,545和國際出版物No.WO?00/17343公開了有用的基于Tn5轉座的體外轉座系統，本文將這兩者全部納入作為參考。

需要具有能識別IE和OE的能力且偏愛結合IE的Tnp蛋白質，使我們能夠指導核酸的轉座，和有助于更復雜的(與用對OE單一特異性的Tnp相比)轉座和基因工程策略(上述專利和應用中所述的)。也需要對IE^ME偏愛性提高的Tnp，因為在普通dam+細菌宿主中DNA的甲基化抑制已有Tn5轉座酶的結合并降低已有轉座酶促進IE限定轉座子移動的能力。

發明概述