[發明專利]通過自我蛋白水解生產蛋白質

有效

• 申請號: 00811071.9
• 申請日: 2000-08-07
• 公開（公告）號: CN1367837A
• 公開（公告）日: 2002-09-04
• 發明（設計）人: T·魯默納福;H－J·塞爾;J·溫迪什;F·克瑙斯德
• 申請（專利權）人: 生物化學有限公司
• 主分類號: C12N15/57
• 分類號: C12N15/57;C12N15/62;C12N15/70;C12N9/50;C12N1/21;C12P21/06;//C07K14/54;14/56;(C12N1/21;C12R119)
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 唐偉杰

本發明涉及一種在細菌宿主細胞中生產具有確定的均一N末端的異源目標多肽的方法，其包括通過N^pro自我蛋白水解活性，由包含具有瘟病毒自我蛋白酶N^pro的自我蛋白酶水解活性的肽和異源多肽的初表達之融合蛋白，經自我蛋白水解得到目標異源多肽。

在異種生物體中生產重組蛋白質，比如在細菌細胞中表達人蛋白質或者其他真核蛋白質，通常很難得到盡可能近乎100％均一的確定N末端，尤其是在重組藥物蛋白質的應用中。這些重組蛋白質的氨基酸序列在很多情況下應該和人或者動物天然蛋白質的氨基酸序列完全相同。

在天然蛋白質的表達中，比如在人中，許多目前在應用的藥物蛋白質被轉運到胞外間隙，切去前體蛋白質中的信號肽，得到N末端確定的蛋白質。在細菌細胞中，由于幾種原因，不容易得到這種均一N末端的蛋白質。

細菌只有很少情況下可以在合適的原核或者真核信號肽序列幫助下，輸到細胞周質。而且因為細菌的功能不強，所以只能積累很少量的產物。

然而，細菌細胞質和真核細胞的胞外區呈明顯不同。一方面，那里是還原條件；另一方面沒有切去N末端前導序列產生成熟蛋白質的機制。所有細胞質蛋白質合成時的第一個氨基酸是甲硫氨酸，也就是起始密碼子ATG編碼的氨基酸。這個N末端甲硫氨酸在很多蛋白質中仍然保留，而在其它一些蛋白質中被宿主細胞質中內在的甲硫氨酸氨肽酶(MAP)切掉了。切除的效率依賴于兩個因素：1，后面氨基酸的性質；2，N末端在蛋白質空間構象中的位置。如果隨后的氨基酸是絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或者纈氨酸，以及N末端暴露，即沒有“埋藏”在蛋白質內部，那么N末端甲硫氨酸優先被切除。另一方面，如果隨后的氨基酸是其它氨基酸，尤其是帶電荷的氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸和精氨酸)，或者如果N末端位于蛋白質內部，則大多數情況下N末端甲硫氨酸不會被切除。(Knippers，Rolf(1995)Molekulare?Genetik，6^thedition，Georg?Thieme?Verlag，Stuttgart，NewYork，ISBN?3-13-103916-7)

而且即使第二位的氨基酸能夠促進甲硫氨酸的切除，切除很少會是完全的。通常有一小部分(1％到50％)沒有被MAP酶切。

在細菌細胞生產重組藥物蛋白的早期，一般的方法是簡單的把編碼甲硫氨酸的起始密碼子ATG加到成熟蛋白質(即沒有信號肽或其他N末端區)的開放閱讀框架(ORF)前面。因而表達出的蛋白質序列為H₂N-Met-目標蛋白質。在少數蛋白質的生產中，含有宿主內在的MAP可以完全切除N末端甲硫氨酸。然而多數用這種方法生產的蛋白質具有不均一N端(N端有Met和N端沒有Met兩種形式的混合物)，或者N端都具有一個額外的外源氨基酸(N端全是甲硫氨酸的形式)。

然而，在很多情況下，這種不均一或者與天然序列不同是不能被接受的，因為這些產物通常具有不同的免疫原性(比如誘導抗體形成方面)和藥理學性質(半衰期，藥代動力學)。由于這些原因，很多情況下必須生產性質相同的蛋白質(N端均一且沒有外來氨基酸)。在細胞質表達中，大多數情況通過在目標蛋白質N端融合一段可以被特定內肽酶(例如因子Xa、腸激酶、KEX內肽酶和IgA蛋白酶)或氨肽酶(例如二肽基氨肽酶)切除的序列來補救。然而，這就使產品在后續處理即所謂的下游純化之前必須增加一個步驟，這將消耗材料和增加費用。

因而需要在細菌細胞中生產目標蛋白質的方法，從而可以得到具有特定均一N端的目標蛋白質，并且不需要增加復雜體外純化步驟(重折疊、純化、蛋白酶水解，進一步純化等)。本發明建立了一個使用瘟病毒自我蛋白酶N^pro的生產蛋白質方法。

瘟病毒構成了一類能夠引起世界范圍豬和反芻動物嚴重經濟損失的病原體。在這些可傳染疾病的病原體中，傳統的豬瘟病毒(classicalswine?fever?virus，CSFV)是非常重要的。牛病毒性腹瀉病毒(bovineviral?diarrhea?virus，BVDV)引起的損失也是相當嚴重的，特別是常常子宮內感染胎牛。

瘟病毒是一種小的包膜病毒，其基因組直接充當mRNA，大小為12.3kb，由此在細胞質中轉錄病毒基因產物。這一過程是以單一多蛋白形式進行的，該多蛋白包括大約4000個氨基酸，在病毒和細胞蛋白酶的作用下，大約被切割成12種成熟蛋白質。