[發明專利]使用昆蟲細胞制備的人乳鐵蛋白及其制備方法

無效

• 申請號: 00810913.3
• 申請日: 2000-07-26
• 公開（公告）號: CN1365390A
• 公開（公告）日: 2002-08-21
• 發明（設計）人: 李運萬;常云喜;郭常喜
• 申請（專利權）人: 數位生物技術株式會社;韓晟化學株式會社
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12
• 代理公司: 隆天國際專利商標代理有限公司
• 代理人: 黃韌敏,楊淑媛

技術領域

本發明涉及采用昆蟲細胞制備的人乳鐵蛋白及其制備方法。具體地說，本發明涉及采用昆蟲細胞制備的人乳鐵蛋白及其制備方法，這種方法包括通過基因重組將人乳鐵蛋白基因轉導進入昆蟲細胞，以及在昆蟲細胞中克隆和表達人乳鐵蛋白基因，利用昆蟲細胞制備人乳鐵蛋白。

人乳鐵蛋白是離子結合的單體糖蛋白的鐵傳遞蛋白家族的一員，也稱作“乳鐵傳遞蛋白”。這種人乳鐵蛋白存在于哺乳動物的奶液包括人的乳液、淚液、唾液、粘膜分泌物和多形核白細胞的次級顆粒體中。1939年，Peter?Sorenson首先發現，開始命名為人類乳液的“紅蛋白質”。

乳鐵蛋白(Lf)首先從牛奶中被分離和提純。自從第一次發現乳鐵蛋白后，已經從其他哺乳動物例如人、鼠、山羊、兔、狗等等的乳液中分離和提純Lf。人類的乳液有較高量的乳鐵蛋白，例如初乳中為6到8mg/ml。但是，在輸送乳液時人乳中的乳鐵蛋白含量下降到大約2mg/ml。如果人乳在輸送過程中被細菌污染，在被污染的奶中，乳鐵蛋白的量突然升高到比正常乳鐵蛋白的量高30倍以上。

人乳鐵蛋白(hLf)是一種分子量為78kDa的糖蛋白，由含有691個氨基酸的單個多肽鏈組成。這個單個多肽由一個2折內重復單元和兩個球狀葉片組成。即人乳鐵傳遞蛋白有C和N葉片分別構成了C端和N端。這兩個葉片有非常相同的結構，C端和N端之間具有高度同源性(高達大約40％以上)。采用近代先進的X射線晶體學測定了乳鐵蛋白的三維結構，每一個C端和N端有一個結合具有高親和性的鐵的位點，而且這樣的一個乳鐵蛋白分子可逆地結合兩個鐵離子(Fe⁺³)(Anderson等，1989)。這樣的一個乳鐵蛋白可以以無鐵狀態(apo型)或是飽和鐵狀態(holo型)存在，這取決于它是否結合了鐵，因而決定了乳鐵蛋白的生物學特性。Apo型乳鐵蛋白存在于正常的人乳汁中。在酸性條件下所有類型的乳鐵蛋白相對于鐵傳遞蛋白幾乎都是穩定的，并且在特定的pH值釋放鐵。

乳鐵蛋白是從外分泌腺分泌的非—免疫球蛋白保護蛋白質之一，直接或間接參與抗菌機制并且因此影響抗病毒作用。乳鐵蛋白具有抗體外和體內各種微生物的抗菌活性。特別是，無鐵狀態(apo型)的乳鐵蛋白有抗革蘭氏陰性細菌例如大腸桿菌、Kleabsiela?pnumoni和產氣桿菌、產氣微生物的抗菌活性，因為它螯合了鐵離子，而這些鐵離子是這些微生物必需的，于是抑制了這些微生物的生長。體外實驗表明，乳鐵蛋白有一種如同抗生素一樣的在一個小時內抗99.99％的細菌例如桿狀菌、大腸桿菌和沙門氏菌的有效的抗菌活性。乳鐵蛋白也參與涉及鐵結合作用的機制，以抑制微生物的生長，并且迅速地破壞細菌的生存能力。在這種機制中，乳鐵蛋白不僅破壞革蘭氏陰性細菌的外膜，以大量釋放構成外膜的脂多糖，從而損壞膜的滲透屏障，而且增加微生物對疏水抗生素例如溶菌酶或利福平的敏感性，因而降低微生物對于抗菌素的抗性。盡管乳鐵蛋白具有抗病原性微生物的作用，據說它并不具有抗有益于人體的細菌例如乳酸菌或Bifidus的抗菌作用。因此乳鐵蛋白可保護新生嬰兒抵抗細菌的感染。而且，在血液中還發現有少量的乳鐵蛋白，由嗜中性粒細胞分泌。這種乳鐵蛋白是嗜中性粒細胞的次級顆粒體的主要組成，而且在炎性反應時大量分泌。有些情況下，在活體中抗感染的病原微生物時，乳鐵蛋白直接對溶菌酶或IgA具有增效作用。由于乳鐵蛋白在抗感染的保護機制中起著重要的作用，不能在體內產生乳鐵蛋白的患者在抗各種疾病的能力上嚴重惡化，增加感染細菌或真菌的可能。另外，乳鐵蛋白在細胞增殖或鐵的傳送吸收方面起著中間介質的作用。技術背景

盡管乳鐵蛋白有各種前述功能，但是因為血液或其他體液中只含有少量的乳鐵傳遞蛋白以及含有大量乳鐵蛋白的初乳試樣太少，許多研究都沒有研究人乳鐵蛋白。由于人乳是非常重要的，對乳鐵蛋白進行仔細研究以利用基因工程方法建立關于在微生物中克隆和表達人乳鐵蛋白(hLf)DNA的微生物的工業應用基礎。但是，如上所述，除非制備出針對大腸桿菌的專門的重組質粒，在基因工程中，廣泛使用大腸桿菌作為表達菌株來提取人乳鐵蛋白(hLf)仍舊是困難的。