[發明專利]來源于馬尼拉水蛭的透明質酸酶,分離、純化和重組生產方法

無效

• 申請號: 00808873.X
• 申請日: 2000-06-06
• 公開（公告）號: CN1355850A
• 公開（公告）日: 2002-06-26
• 發明（設計）人: M·科多維茨;D·古索;U·霍夫曼;T·帕庫茨卡;A·加達斯
• 申請（專利權）人: 默克專利股份有限公司
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N9/26;A61K38/43
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 樊衛民

本發明涉及一種來源于熱帶水蛭馬尼拉水蛭(Hirudinariamanillensis)的新型透明質酸酶的分離、純化和表征。因此，根據本發明，這種新酶被稱為“馬尼拉水蛭酶(manillase)”。本發明還涉及馬尼拉水蛭酶的重組生產方法，包括DNA和氨基酸序列以及表達載體和宿主系統的公開。最后，本發明涉及馬尼拉水蛭酶用于治療目的的用途，例如，用于治療心肌疾病、血栓事件和腫瘤。

透明質酸或hyaluronan(HA)是線性不分支的高分子量(2-6×10⁶)葡糖胺聚糖，由重復二糖結構GlcNAc(β1-4)GlcUA組成。其羧基在胞外液體的優勢pH下完全離子化，無論是正常的或病理的。HA與硫酸軟骨素、硫酸角質素和肝素均屬于葡糖胺聚糖類(Jeanloz?R.W.，風濕性關節炎(Arthr?Rheum.)1960，3，233-237)。與其他未修飾的葡糖胺聚糖(GAG)不同，它沒有硫酸取代或共價連接的肽，其鏈長度和分子量通常極高。HA普遍分布于結締組織中，在引入改進的固定方法(Hellstrom?S.等人，1990，組織化學雜志(Histochem.J.)22，677-682)和利用hyaluronan結合肽(HABP)的特異組織化學方法后，實際上在身體的所有部分中均發現。它在發育和成熟過程中也存在于神經外胚層來源的組織中。

術語透明質酸酶根據本發明通常是指一種酶，其作用于透明質酸，而無論其對其他底物的活性如何。

透明質酸酶首先從微生物中而后從哺乳動物睪丸中分離，后者現在是其主要來源(Meyer，K.《酶》，1971，307)。

根據反應機制，透明質酸酶被分為主要三類。

第一類微生物酶包括通過β-消除作用于其底物，產生A-4，5-不飽和二糖。因此該酶必須被命名為透明質酸裂合酶，EC?4.2.99.1。

第二類，透明質酸氨基葡糖苷酶或睪丸型透明質酸酶(EC?3.2.1.35)作為一種內切N-乙酰-β-D-己糖胺酶，將HA降解為較小的片段，首先是在游離還原末端含有己糖胺部分的四糖。與睪丸透明質酸酶有類似性質的酶已經從蝌蚪、蛇毒、蜂毒、大量動物組織、人血清和其他來源中獲得。眾所周知，來自睪丸的透明質酸酶也具有轉糖基酶活性(WeissmanB.等人，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)1954，208，417-429)。屬于這類透明質酸酶的酶顯示不僅對于透明質酸而且對于軟骨素-4-硫酸、軟骨素-6-硫酸、軟骨素和硫酸皮膚素的酶活性。

第三類由透明質酸葡糖苷酸酶(EC?3.2.1.36)組成，其作為一種內切-β-葡糖苷酸酶。該酶從歐洲醫蛭(Hirudo?medicinalis)中分離(Yuki?H.和Fishman?W.H.，生物化學雜志1963，238，1877-79)，對HA絕對特異。硫酸軟骨素、皮膚素和肝素不是該透明質酸酶的底物。它只將透明質酸降解為在游離還原末端含有葡糖醛酸的四糖(Linker?A.等人，生物化學雜志1960，235，924-27)。與哺乳動物內切-β-葡糖胺酶相反，肝素對該水蛭透明質酸酶的活性沒有影響。因此，它能與肝素一起對患者施用，其衍生物被廣泛用作抗凝劑。EP?0?193?330中公開了來源于水牛水蛭的蛭科亞科(包括Hirudinaria、Illebdella、Poecilodbella、Sanguisoga屬)種(Poecilodbella?granulosa)的透明質酸特異的內切-β-葡糖苷酸酶(稱為“orgelase”)，其分子量約為28.5。