[發明專利]來源于馬尼拉水蛭的透明質酸酶,分離、純化和重組生產方法

無效

• 申請號: 00808873.X
• 申請日: 2000-06-06
• 公開（公告）號: CN1355850A
• 公開（公告）日: 2002-06-26
• 發明（設計）人: M·科多維茨;D·古索;U·霍夫曼;T·帕庫茨卡;A·加達斯
• 申請（專利權）人: 默克專利股份有限公司
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N9/26;A61K38/43
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 樊衛民

1.一種從水蛭種馬尼拉水蛭中分離的純化的蛋白質，其具有透明質酸酶的生物活性，其活性不受肝素影響，其特征在于根據糖基化其分子量為53-60。

2.根據權利要求1的糖基化蛋白質，其分子量為58(±2)。

3.根據權利要求1的非糖基化蛋白質，其分子量為54(±2)。

4.根據權利要求1-3任一項的蛋白質，其等電點為7.2-8.0。

5.根據權利要求1-4任一項的蛋白質，其具有圖7和SEQ?ID?No.1所示的氨基酸序列。

6.根據權利要求1-5的蛋白質，其酶比活＞100kU/mg蛋白質。

7.一種分離并純化如權利要求1-6所述蛋白質的方法，其包括下列步驟：

(i)用酸性緩沖液勻漿馬尼拉水蛭種的水蛭的頭和離心，

(ii)硫酸銨沉淀步驟(i)的上清液，

(iii)陽離子交換層析，

(iv)伴刀豆球蛋白A親和層析，

(v)疏水作用層析，

(vi)在用透明質酸片段包被的基質上親和層析，

(vii)凝膠滲透層析，和任選地，

(viii)純化蛋白質的酶促或化學去糖基化。

8.一種具有透明質酸酶生物活性的蛋白質，其活性不受肝素影響，根據糖基化其分子量為53-60，可通過權利要求7的步驟獲得。

9.根據權利要求8的蛋白質，其酶比活＞100kU/mg蛋白質。

10.一種編碼權利要求1和9的蛋白質的DNA序列。

11.一種編碼權利要求8的蛋白質的DNA序列，其含有圖8(SEQ?IDNo.2)、圖9(SEQ?ID?No.4)和圖10(SEQ?ID?No.6)所示的任一核苷酸序列。

12.一種重組蛋白，其具有透明質酸酶生物活性，由權利要求11的任一DNA序列編碼。

13.一種重組蛋白，其具有透明質酸酶生物活性，根據糖基化其分子量為55-59，含有圖8、9和10(SEQ?ID?No.3、5、7)所示的任一氨基酸序列或與該序列至少80％同源的序列。

14.含有權利要求10或11的DNA序列的一種表達載體。

15.用權利要求14的載體轉化的一種適于表達權利要求12或13的蛋白質的宿主細胞。

16.根據權利要求1-6、8、9、12和13任一項的一種蛋白質，作為一種藥物。

17.一種藥用組合物，其含有權利要求16的蛋白質和藥學可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。

18.一種藥用組合物，其還含有一種藥理活性化合物。

19.根據權利要求18的一種藥用組合物，其中藥理活性化合物是肝素。

20.根據權利要求1-6、8、9、12和13任一項的蛋白質在生產可治療心肌、心血管和血栓疾病和腫瘤的藥物中的用途。