[發(fā)明專利]用氣單胞菌氨肽酶由多肽除去N末端丙氨酸殘基的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 00808282.0
• 申請日: 2000-04-26
• 公開（公告）號: CN1353755A
• 公開（公告）日: 2002-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: J·S·陶;D·W·泰勒
• 申請（專利權(quán)）人: 法瑪西雅公司
• 主分類號: C12N15/18
• 分類號: C12N15/18;C12P21/06;C07K14/575;C07K14/18;//C12N9/48
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進委員會專利商標事務(wù)所
• 代理人: 唐偉杰

???????????????????????優(yōu)先權(quán)

本申請要求根據(jù)35U.S.C.§119授予1999年4月30日提交的美國臨時申請流水號60/132,062的優(yōu)先權(quán)。

???????????????????????發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明描述了使用由海洋細菌解蛋白氣單胞菌(Aeromonasproteolytica)衍生的氨肽酶，由多肽(優(yōu)選重組蛋白質(zhì))除去N末端丙氨酸殘基的方法。由此，氣單胞菌氨肽酶(APP；E.C.3.4.11.10)可以用于(例如)由人生長激素(hST或hGH)、豬生長激素(pST)、和牛生長激素(bST)的衍生物除去N末端丙氨酰基殘基，從而產(chǎn)生具有天然氨基酸序列的蛋白質(zhì)。可以在自由的溶液中進行酶反應(yīng)，或者可以將AAP固定在固相支持物上，用于在體外進行反應(yīng)。用于(例如)將Ala-hGH轉(zhuǎn)變成hGH的有效方法包括：在大腸桿菌中表達Ala-hGH，回收包涵體，在去污劑中溶解并重新折疊，通過超濾除去去污劑，選擇性沉淀，酶切割，然后進行兩種柱層析步驟。

?????????????????????發(fā)明背景

非常需要模擬或具有天然蛋白質(zhì)相同結(jié)構(gòu)的重組蛋白質(zhì)，這些重組蛋白質(zhì)可用于治療性應(yīng)用，作為疫苗和診斷性檢驗試劑盒的成分，以及作為結(jié)構(gòu)/功能研究的試劑。一般使用哺乳動物、細菌、和昆蟲的細胞來表達用于這些應(yīng)用的重組蛋白質(zhì)。然而，當需要大量蛋白質(zhì)用于實驗性或臨床性研究時，而且蛋白質(zhì)能夠重新折疊成正確構(gòu)象，一般使用細菌表達系統(tǒng)。具體而言，當最終的蛋白質(zhì)產(chǎn)物不要求或不需要真核細胞的翻譯后修飾(如糖基化)時，細菌系統(tǒng)與其它表達載體系統(tǒng)相比提供了顯著的成本優(yōu)勢。

在細菌(諸如大腸桿菌)中表達的重組蛋白質(zhì)常常隔絕在不溶性包涵體中。由包涵體收獲的異源蛋白質(zhì)常常保留額外的氨基酸殘基，諸如位于氨基末端的甲硫氨酸。然而，由真核宿主細胞收獲的天然或重組蛋白質(zhì)常常不存在由ATG起始密碼子編碼的這一甲硫氨酸。然而，在大腸桿菌細胞質(zhì)中產(chǎn)生的許多蛋白質(zhì)的氨基末端受到酶的加工，諸如甲硫氨酸氨肽酶(Ben?Bassat等人，細菌學雜志(J.Bacteriol.)169：751-757，1987)，使得表達后一般由N末端切除甲硫氨酸。

蛋白質(zhì)末端的氨基酸組成以許多不同方式存在差異(Berezovsky等人，蛋白質(zhì)工程(Protein?Engineering)12(1)：23-30，1999)。N-外肽酶活性的系統(tǒng)檢驗導致了“N末端規(guī)則”的發(fā)現(xiàn)：若下一個氨基酸是Ala、Cys、Gly、Pro、Ser、Thr、或Val，則切除N末端(f)Met；若下一個氨基酸是Arg、Asp、Asn、Glu、Gln、Ile、Leu、Lys、或Met，則起始(f)Met仍然作為成熟蛋白質(zhì)的第一個氨基酸。有人提出氨基酸側(cè)鏈的水合半徑是這些發(fā)現(xiàn)的物理學基礎(chǔ)(Bachmain等人，科學(Science)234：179-186，1986；Varshavsky，細胞(Cell)69：725-735，1992)。蛋白質(zhì)半衰期(3分鐘-20小時)受到N末端氨基酸化學結(jié)構(gòu)的顯著影響(Stewart等人，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)270：25-28，1995；Griegoryev等人，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)271：28521-28532，1996)。隨后使用定點誘變來確認‘N末端規(guī)則”，即監(jiān)測改變了N末端氨基酸序列的重組蛋白質(zhì)的壽命(Varshavsky，美國國家科學院進展(Proc.Natl.Aead.Sci.USA)93：12142-12149，1996)。蛋白質(zhì)N末端氨基酸序列的統(tǒng)計學分析提出，Met和Ala殘基過度展示于第1位，而第+2位和第+5位優(yōu)選Thr(Berezovsky等人，蛋白質(zhì)工程(Protein?Engineering)12(1)：23-30，1999)。然而，C末端偏倚顯示，優(yōu)選帶電荷的氨基酸和Cys殘基(Berezovsky等人，蛋白質(zhì)工程(Protein?Engineering)12(1)：23-30，1999)。

在有些情況中，保留N末端甲硫氨酸的重組蛋白質(zhì)的生物學特征與不含N末端甲硫氨酸的天然種類不同。例如，與由天然來源純化的hGH或以某種方式制備使得一級序列與天然hGH(不含N末端甲硫氨酸)相同的重組hGH相比，保留N末端甲硫氨酸的人生長激素(Met-hGH)能夠促進非所需抗體的誘導。治療性應(yīng)用一般非常需要生產(chǎn)模擬天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重組蛋白質(zhì)的低成本方法(Sandman等人，生物技術(shù)(Bio/Technology)13：504-506，1995)。