[發明專利]α－L－天冬氨酰－L－苯丙氨酸的微生物學生產方法

無效

• 申請號: 00808250.2
• 申請日: 2000-03-28
• 公開（公告）號: CN1353757A
• 公開（公告）日: 2002-06-12
• 發明（設計）人: S·德克爾;M·A·馬拉希爾;P·J·L·M·夸伊德弗利格;T·松克
• 申請（專利權）人: 荷蘭加甜劑公司
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/62;C12N9/00;C07K5/06
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 張廣育,譚明勝

發明領域

本發明涉及一種用底物L-天冬氨酸(L-Asp)和L-苯丙氨酸(L-Phe)生產α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸(Asp-Phe)的新型微生物學方法。本發明還涉及編碼一種新型Asp-Phe二肽合成酶的新型DNA片段或DNA片段的組合，含有所述DNA片段的微生物，以及所述新型Asp-Phe二肽合成酶本身。

發明背景

α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸(以下又稱之為Asp-Phe)是一種重要的二肽，特別是被用于生產α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯(以下又稱之為APM)。已知APM是一種高強度人工增甜劑，其甜度大約為蔗糖甜度的200倍。β-形式的APM立體異構體(其中，一個或兩個氨基酸為D-構型)不具有甜度特征。APM被用于對各種食用材料進行增甜。

現有各種APM生產方法；現有的方法可以劃分為化學和生物化學/微生物學(特別是酶學)方法。在用已知的肽合成技術生產APM的方法中，為了實現選擇性的α-L，L-連接，必須進行繁瑣的、并且代價昂貴的工藝，包括對α-氨基、羧基和側鏈基團進行強化保護和脫保護。另一方面，發酵方法通常是廉價的，并且，它本身具有對映體-和區域選擇性。因此，發酵方法一直被認為是上述化學和生物化學合成方法的有希望的替代方法。通過EP-A-0036258可以看出，到目前為止，一直認為不適合將二肽Asp-Phe作為微生物自身蛋白生產過程的一部分在微生物中生產；理論上講，通過將核苷酸堿基序列GAC或GAT(已知是L-Asp的密碼子)和TTT或TTC(已知為L-Phe密碼子)插入微生物的DNA中可以實現所述生產，將所述堿基序列插入正確的讀框中，在其前面和后面有合適的加工或終止密碼子，并且受到合適的控制。因此，在EP-A-0036258中，嘗試了通過預先生產結構式(Asp-Phe)n的蛋白片段間接合成Asp-Phe，其中，n是一個大的數字；這一目的是通過在一種克隆載體中插入編碼所述聚-(Asp-Phe)蛋白的合成DNA-片段而實現的。不過，所述核糖體發酵方法仍然繁瑣，并且在經濟上也沒有吸引力。主要問題在于從所述多肽中回收Asp-Phe二肽。類似地缺陷可歸因于由Choi，S.Y.等所披露的一種方法，參見J.Microbiol.Biotechnol.，2，1992，1-6頁，其中，合成了一種含有Asp-Phe-Lsy的三肽序列的片段的多肽。因此，仍然存在尋找Asp-Phe的直接發酵方法的必要性。到目前為止尚不了解Asp-Phe的直接發酵。

發明詳述生產Asp-Phe的方法：

令人吃驚的是，本發明人現在發現了一種用底物L-天冬氨酸(L-Asp)和L-苯丙氨酸(L-Phe)生產α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸(Asp-Phe)的新型的、有希望的替代的微生物學方法，其中，在有有效量的腺苷三磷酸(ATP)存在的條件下，讓所述底物與包括通過一個縮合結構域連接的兩個最小組件的非核糖體二肽合成酶接觸，其中，所述組件的N-末端組件識別L-天冬氨酸，而所述組件的C-末端組件識別L-苯丙氨酸，并且，其N-末端與所述縮合結構域共價結合，其中，所述每一個最小組件由一個腺苷酸化結構域和一個含有硫醇化結構域的4’-磷酸泛酰巰基乙胺輔助因子組成，并回收所形成的Asp-Phe。

因此，這種新方法提供了一種直接發酵Asp-Phe的微生物學方法，隨后通過一個甲基化步驟可將其轉化成高效增甜劑天冬苯丙二肽酯。到目前為止，通過直接發酵生產Asp-Phe的方法與這種二肽的非核糖體合成方法一樣是未知的。因此，本發明人提供了一種生產二肽Asp-Phe的直接微生物學方法，不需要任何保護和脫保護步驟。