[發明專利]α－L－天冬氨酰－L－苯丙氨酸的微生物學生產方法

無效

• 申請號: 00808250.2
• 申請日: 2000-03-28
• 公開（公告）號: CN1353757A
• 公開（公告）日: 2002-06-12
• 發明（設計）人: S·德克爾;M·A·馬拉希爾;P·J·L·M·夸伊德弗利格;T·松克
• 申請（專利權）人: 荷蘭加甜劑公司
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/62;C12N9/00;C07K5/06
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 張廣育,譚明勝

1.用底物L-天冬氨酸(L-Asp)和L-苯丙氨酸(L-Phe)生產α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸(Asp-Phe)的微生物學方法，其中，在有有效量的腺苷三磷酸(ATP)存在的條件下，讓所述底物與包括通過一個縮合結構域連接的兩個最小組件的非核糖體二肽合成酶接觸，其中，所述組件的N-末端組件識別L-天冬氨酸，而所述組件的C-末端組件識別L-苯丙氨酸，并且，其N-末端與所述縮合結構域共價結合，其中，所述每一個最小組件由一個腺苷酸化結構域和一個含有硫醇化結構域的4’-磷酸泛酰巰基乙胺輔助因子組成，并回收所形成的Asp-Phe。

2.如權利要求1的生產Asp-Phe的方法，其特征在于所述二肽合成酶上的縮合結構域以如下方式與兩個最小組件連接：它還能與識別L-天冬氨酸的組件共價結合。

3.如權利要求1或2的生產Asp-Phe的方法，其特征在于還存在一種用于釋放在所述二肽合成酶上所形成的Asp-Phe的釋放因子。

4.如權利要求1-3中任一項的生產Asp-Phe的方法，其特征在于所述釋放因子是一種蛋白，該蛋白具有硫酯酶樣功能，并且在其C-末端構成所述二肽合成酶的整合的結構域。

5.如權利要求1-4中任一項的生產Asp-Phe的方法，其特征在于在生產Asp-Phe之前，所述二肽合成酶業已用一種或多種翻譯后修飾活性對其功能進行了優化。

6.如權利要求5的生產Asp-Phe的方法，其特征在于使用4’-磷酸泛酰巰基乙胺(4’-PP)轉移酶作為翻譯后修飾活性。

7.如權利要求1-6中任一項的生產Asp-Phe的方法，其特征在于還有一種具有II型硫酯酶樣活性的非整合蛋白與所述二肽合成酶同時存在。

8.如權利要求1-7中任一項的生產Asp-Phe的方法，其特征在于所述二肽合成酶存在于微生物的活的細胞材料中，將葡萄糖、L-Asp和/或L-Phe添加到所述發酵罐中，并且回收所形成的Asp-Phe。

9.如權利要求8的生產Asp-Phe的方法，其特征在于在Asp-Phe二肽合成酶開始表達之前，首先讓所述微生物在一種發酵罐中生長到預定的細胞密度，并添加葡萄糖、L-Asp和/或L-Phe以便啟動Asp-Phe二肽的合成。

10.如權利要求9的生產Asp-Phe的方法，其特征在于所述微生物是能產生L-苯丙氨酸的微生物，并且僅添加葡萄糖和L-Asp。

11.如權利要求10的生產Asp-Phe的方法，其特征在于所述微生物是埃希氏菌或芽孢桿菌。

12.如權利要求8-11中任一項的生產Asp-Phe的方法，其特征在于所使用的微生物是具有針對Asp-Phe的減弱了的蛋白酶活性的或者缺乏針對Asp-Phe的活性的菌株。

13.如權利要求8-12中任一項的生產Asp-Phe的方法，其特征在于所使用的微生物還含有一種用于輸出所形成的Asp-Phe的合適的輸出系統和/或一種或多種用于吸收葡萄糖和/或L-Asp和/或L-Phe的合適的吸收系統。

14.如權利要求1-7中任一項的生產Asp-Phe的方法，其特征在于Asp-Phe的生產是在酶反應器中體外進行的，同時補充ATP并添加L-Asp和/或L-Phe，并回收所形成的Asp-Phe。

15.如權利要求14的生產Asp-Phe的方法，其特征在于ATP的補充其一部分是由原位ATP-再生系統提供的。

16.如權利要求15的生產Asp-Phe的方法，其特征在于所述ATP再生系統存在于透化微生物中。

17.一種編碼非核糖體Asp-Phe二肽合成酶的DNA片段或DNA片段的組合，所述合成酶包括兩個通過一個縮合結構域連接的最小組件，其中，所述組件中N-末端組件能識別L-天冬氨酸，而所述組件中的C-末端組件能識別L-苯丙氨酸，并且其N-末端與所述縮合結構域共價結合，其中，所述最小組件中的每一個包括一個腺苷酸化結構域和一個含有硫醇化結構域的4’-磷酸泛酰巰基乙胺輔助因子。