[發明專利]從新的融合蛋白制造重組胰島素的方法

無效

• 申請號: 00806934.4
• 申請日: 2000-04-26
• 公開（公告）號: CN1350584A
• 公開（公告）日: 2002-05-22
• 發明（設計）人: 岡周作;佐藤靜治;東久邇真彥;近藤雅昭;工藤季之;渡邊重明;脅能宏;結城寬孝
• 申請（專利權）人: 伊藤火腿株式會社
• 主分類號: C12N15/17
• 分類號: C12N15/17;C12N15/03;C07K19/00;C07K14/575
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 丁業平,王維玉

發明的背景

1技術領域

本發明涉及編碼新的融合蛋白的DNA，所述融合蛋白被用來制備重組胰島素。更具體地講，本發明涉及利用所述DNA從所述融合蛋白制備胰島素，通過DNA的表達以及凝血酶和羧肽酶B的作用來制備胰島素。

2背景技術

胰島素是攝取食物時胰臟中從胰島的B細胞里分泌出來的是一種儲藏和利用糖類、氨基酸、脂肪酸等保持血糖值正常的最重要的激素。血糖為血液中葡萄糖，是生物體中不可缺少的能源。血糖值紊亂時，生物體會表現出嚴重異常。血糖值高時，發生尿糖，從而導致葡萄糖損失，也就是常說的患了糖尿病。這種狀態持續下去，生物體的部分組織會出現并發癥。另外，血糖值低下時，能量來源供應不上，生命就會出現危險。血糖值由促血糖上升的促進因子(葡萄糖原、生長激素、氫化可的松、兒茶酚胺)以及降糖因子互作而保持恒定。胰島素為唯一能夠降低血糖值的激素。因此，不論什么原因只要導致胰島素的分泌降低、胰島素不夠體內所需時，就會患胰島素依賴型糖尿病(IDDM)。治療這樣的患者，胰島素是必須的醫藥品。

人類的胰島素由21個氨基酸連接而成的A鏈和30個氨基酸連接而成的B鏈構成的多肽，A鏈內有1個二硫鍵，A和B鏈之間由兩個二硫鍵連接。胰島素為在胰臟中胰島的B細胞的核糖體上最初作為前胰島素原合成出來。前胰島素原是含有由24個氨基酸組成的信號肽鏈(SP)、B鏈(B)、31個氨基酸組成的C肽鏈以及A鏈(A)按照以“SP-B-C-A”這個順序直線排列的分子。當前胰島素原進入內質網時，信號肽鏈被切掉，成為胰島素原(B-C-A)。胰島素原在內質網內形成二硫鍵。形成三維結構之后，激素原轉化酶PC1/3將胰島素原在B-C結合位點切斷，然后轉化酶PC2又將C-A結合位點切斷。最后，當用PC1/3酶切時仍保留在B鏈的C末端，即，C肽上的N末端的2個堿性氨基酸被羧肽酶H剪切后成為胰島素。

歷史上，治療用胰島素的生產法的開發是采用從?；蜇i等動物的胰臟的抽提物發展起來的。但是和人類的胰島素組成相比，牛胰島素的A鏈中有兩個、B鏈中有一個氨基酸和人類的不同；豬胰島素的B鏈中有一個氨基酸和人類的不相同，用牛或豬胰島素進行治療時無法避免過敏之類的副作用。后來又開發出通過胰蛋白酶處理豬胰島素的利用轉肽基反應的人類胰島素的半合成方法。然而通過基因重組技術生產出的基因重組胰島素，因具有價格低和效率高的特點而成為主流產品。

基因重組胰島素的制造方法開發出許多種。例如，Eli?Lilly公司發明的方法是已知的，該方法用大腸桿菌分別表達A鏈和B鏈，在體外將A鏈和B鏈混合，形成二硫鍵將A鏈和B鏈連接(JP-B-18960號公報)，然而，該方法生產效率并不高。之后，該公司又開發出一種改進的方法，包括表達胰島素原，并在體外形成二硫鍵連接之后，再用胰蛋白酶和羧肽酶B將C肽鏈從產物中切除而制成胰島素(JP-B-1-48278號公報，日本專利第2634176號)。

Novo?Nordisk公司開發出了另一種方法，該方法包括利用酵母表達含有通過兩個堿性氨基酸殘基連接起來的A鏈和B鏈的微型胰島素原，然后在體外用胰蛋白酶處理該微型胰島素原獲得胰島素(JP-B-7-121226號公報，JP-B-8-8871號公報，專利第2553326號公報)。這種方法具有優點，即，在微型胰島素原表達和分泌的過程中二硫鍵形成，并且因微型胰島素原分泌到培養基中而容易將其分離和純化。

重組胰島素的新制法一直被不斷地開發著。Hoechst公司開發了一種方法，該方法包括用大腸桿菌表達新型的胰島素衍生物或前胰島素原，在體外形成二硫鍵連接，然后用賴氨酰內肽酶或梭菌蛋白酶(clostripain)/羧肽酶B處理從而獲得胰島素。(JP-A-2-195896號公報，JP-A-2-225498號公報，JP-A-2-233698號公報，JP-A-3-169895號公報，JP-A-4-258296號公報，JP-A-6-228191號公報，和JP-A-7-265092號公報)。最近，Bio-technology?General?Corp.開發出了一種方法，用大腸桿菌表達過氧化物歧化酶(SOD與胰島素原連接的融合蛋白，以提高兩種蛋白的表達效率和二硫鍵的形成效率，通過胰蛋白酶和羧肽酶B將胰島素原轉化為胰島素(WO96/20724)。因此，有許多制備重組胰島素的途徑，而且在表達效率、二硫鍵的形成效率以及胰島素轉化方面等等有了不少改進。