[發(fā)明專(zhuān)利]從新的融合蛋白制造重組胰島素的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 00806934.4
• 申請(qǐng)日: 2000-04-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN1350584A
• 公開(kāi)（公告）日: 2002-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 岡周作;佐藤靜治;東久邇真彥;近藤雅昭;工藤季之;渡邊重明;脅能宏;結(jié)城寬孝
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 伊藤火腿株式會(huì)社
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/17
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/17;C12N15/03;C07K19/00;C07K14/575
• 代理公司: 中原信達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 丁業(yè)平,王維玉

1.編碼下式(I)所示融合蛋白的DNA：

[Y]-[X1]-[B-鏈]-[X2]-[連接物]-[X3]-[A-鏈]???????????????(式I)

其中

Y是用于蛋白質(zhì)的表達(dá)和分泌的包含至少一個(gè)氨基酸殘基的引導(dǎo)肽序列，

X1是可酶切或者化學(xué)裂解的氨基酸序列，

B-鏈?zhǔn)且葝u素B鏈的氨基酸序列，

X2是可酶切的氨基酸序列，

連接物是具有至少一個(gè)氨基酸殘基的連接序列，

X3是可酶切的氨基酸序列，以及

A-鏈?zhǔn)且葝u素A鏈的氨基酸序列，并且

Y、X1、B-鏈、X2、連接物、X3和A-鏈按照式I所示的順序連接。

2.編碼下式(II)所示融合蛋白的DNA：

[B-鏈]-[X2]-[連接物]-[X3]-[A-鏈]????????????????(式II)

其中

B-鏈?zhǔn)且葝u素B鏈的氨基酸序列，

X2是可酶切的氨基酸序列，

連接物是具有至少一個(gè)氨基酸殘基的連接序列，

X3是可酶切的氨基酸序列，以及

A-鏈?zhǔn)且葝u素A鏈的氨基酸序列，并且

B-鏈、X2、連接物、X3和A-鏈按照式II所示的順序連接。

3.如權(quán)利要求1或2所述的DNA，其中用于酶切融合蛋白的氨基酸序列X1、X2、X3可被凝血酶切斷。

4.如權(quán)利要求3所述的DNA，其中用于酶切融合蛋白的氨基酸序列X1、X2或X3具有如下序列：

X1＝GlySerLeuGlnProArg???????????(SEQ?ID?NO：1)

X2＝ArgGlyHisArgPro????????????(SEQ?ID?NO：2)和

X3＝ProArg。

5.如權(quán)利要求1或2所述的DNA，其中連接物的氨基酸序列如下：

GluAlaGluAspLeuGlnValGlyGlnValGluLeuGlyGlyGlyProGlyAlaGlySerLeuGlnProLeuAlaLeuGluGlySerLeuGln??(SEQ?ID?NO：3)

6.如權(quán)利要求1所述的DNA，其中引導(dǎo)肽序列包括來(lái)自芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌的細(xì)胞壁蛋白(CWP)之一的MWP蛋白的N末端的9個(gè)氨基酸殘基。

7.權(quán)利要求1所述的DNA，其中該DNA具有與該DNA的5’末端相連的CWP信號(hào)肽。

8.一種DNA，其含有編碼由SEQ?ID?NO：21所示氨基酸序列的核苷酸序列。

9.權(quán)利要求8所述的DNA，其中該DNA含有由SEQ?ID?NO：20所示的核苷酸序列。

10.一種DNA，該DNA含有包含用于在原核生物或真核生物中表達(dá)重組蛋白所必需的啟動(dòng)子區(qū)域的DNA序列，該DNA序列與 1、2和8中任一項(xiàng)所述的DNA的5’末端連接。

11.權(quán)利要求10所述的DNA，其中所述的包含啟動(dòng)子區(qū)域的DNA序列來(lái)自芽孢桿菌屬的細(xì)菌。

12.權(quán)利要求11所述的DNA，其中所述的包含啟動(dòng)子區(qū)域的DNA序列來(lái)自芽孢桿菌屬細(xì)菌的CWP。

13.一種載體，其含有權(quán)利要求10所述的DNA。

14.一種宿主細(xì)胞，其是被權(quán)利要求13所述的載體轉(zhuǎn)化的。

15.芽孢桿菌屬的細(xì)菌，其是被權(quán)利要求13所述的載體轉(zhuǎn)化的。

16.權(quán)利要求15的細(xì)菌，其中該細(xì)菌是短桿菌(Bacillus?brevis)。

17.制備胰島素的方法，其中該方法包括：

在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求14所述的宿主細(xì)胞或權(quán)利要求15所述的細(xì)菌，以便在所述宿主細(xì)胞或細(xì)菌中表達(dá)由目的DNA編碼的融合蛋白；

收集融合蛋白；和

對(duì)融合蛋白進(jìn)行酶切處理以分離出胰島素。

18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的融合蛋白包含由SEQ?IDNO：21所示的氨基酸序列。