[發(fā)明專利]胰羧肽酶原B、其同工型和突變蛋白的制備及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 00806080.0
• 申請日: 2000-03-23
• 公開（公告）號: CN1346407A
• 公開（公告）日: 2002-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: P·哈勃曼
• 申請（專利權(quán)）人: 阿文蒂斯藥物德國有限公司
• 主分類號: C12N15/57
• 分類號: C12N15/57;C12N9/48;C12N1/19;C07K14/62
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進委員會專利商標事務(wù)所
• 代理人: 唐偉杰

本發(fā)明涉及羧肽酶B和羧肽酶原B的制備以及羧肽酶原B在制備生物技術(shù)方法中有用的羧肽酶B中的用途。

羧肽酶是一組含鋅的切割蛋白質(zhì)和多肽的酶(蛋白酶)，它從待降解蛋白或肽的羧基端逐個水解去除單個氨基酸。因此羧肽酶屬于外肽酶。動物羧肽酶在胰腺中以前體(羧肽酶原)形式形成，并在小腸中經(jīng)胰蛋白酶水解成活性形式，在小腸中動物羧肽酶對蛋白質(zhì)初級裂解產(chǎn)物多肽的消化非常重要。不同羧肽酶間存在底物特異性上的差異。

例如，羧肽酶B只釋放堿性氨基酸，如精氨酸、賴氨酸和鳥氨酸。羧肽酶有助于蛋白質(zhì)和多肽的序列分析，有助于確定羧基端氨基酸。而且可用羧肽酶B來測量蛋白。

羧肽酶B應(yīng)用的工業(yè)實例是制備一種重要藥物胰島素，歐洲專利申請EP-A?0?489?780中描述了這種多肽激素的制備。在這個申請中，羧肽酶B用在將胰蛋白酶打開的胰島素原轉(zhuǎn)變成胰島素的一個重要步驟中。

通常，這類工業(yè)方法中使用的羧肽酶B來源于可經(jīng)商業(yè)途徑獲得的羧肽酶原B制品。優(yōu)選該制品從豬胰腺中獲得(Folk，J.E.，Meth.Enzym.：19，504，1970)

然而，動物來源酶的一個缺陷是有被動物病毒污染的危險，而無病毒檢測既復(fù)雜又是計算制備成本的一個重要因素。如果這種酶用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，例如工業(yè)生產(chǎn)胰島素，另一個不利的因素是獲得和儲藏冷凍胰腺的高后勤成本。

除了從胰腺組織中提取羧肽酶B，用生物技術(shù)生產(chǎn)羧肽酶B是另一替代方法。這一方法中有一些已知的路線，例如直接胞內(nèi)表達或在細茵中以融合蛋白形式，如以β-半乳糖苷如羧肽酶B融合蛋白形式表達，或在酵母中進行相應(yīng)表達。這一方法的另一替代方法是表達羧肽酶B前體，即羧肽酶原B，它包括羧肽酶B的氨基酸序列和一段引導(dǎo)表達產(chǎn)物分泌的信號肽序列。對于枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、大腸桿菌(E.coli)以及酵母屬(Saccharomyces)、假絲酵母屬(Candida)、多形漢遜酵母(Hansenula?polymorphus)和巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)，已描述了合適的表達系統(tǒng)，它們有時可以通過商業(yè)途徑獲得。

用表達系統(tǒng)制備羧肽酶B的先決條件是有活性的羧肽酶B在每種情況下不抑制宿主茵的生長，使得確實有可能第一次得以表達。具有這種性質(zhì)的宿主菌通常難以發(fā)酵，以致擴大培養(yǎng)體積和延長培養(yǎng)時間產(chǎn)量提高相對較低。

胞內(nèi)表達羧肽酶B(直接表達或以融合蛋白形式表達)的一個問題是表達蛋白初始以不正確空間結(jié)構(gòu)存在，因而無活性。需在純化和處理過程中體外重新折疊。在此過程中，可能會發(fā)生錯誤折疊，而影響酶活性和特異性，難以用于藥物制備。

通過分泌成熟而有活性的酶的方式制備羧肽酶B也有其缺陷。在發(fā)酵過程中，細胞或營養(yǎng)培養(yǎng)基組份中的肽樣片段被識別為底物，與羧肽酶B相互作用使其不斷失活，導(dǎo)致產(chǎn)量的損失。

解決這個難題的方法是表達和分泌沒有活性但有正確空間結(jié)構(gòu)的羧肽酶B。體外經(jīng)酶催化可從這種前體制備有活性的羧肽酶B。本文中“活性羧肽酶B”意為天然存在的羧肽酶B，如人羧肽酶B或其天然存在的同工型?！盎钚贼入拿窧”也可能是天然存在羧肽酶B的突變蛋白，其中氨基酸序列發(fā)生缺失、插入或替換，但突變蛋白酶活性在質(zhì)量上與天然羧肽酶B相當。提及的前體可以是天然的羧肽酶原B或其衍生物，例如同工型、突變蛋白或因插入肽序列而失活的羧肽酶B。下文會詳細描述所加蛋白序列的性質(zhì)。優(yōu)選羧肽酶原B或其衍生物，因為可很容易地控制從這些蛋白制備有活性的羧肽酶B。而且，提及的羧肽酶原B及其衍生物相對能夠保存更長時間，而羧肽酶B保存時酶活性會丟失。

提及的羧肽酶原B衍生物含有羧肽酶B氨基酸序列以及N末端連接的具有信號肽氨基酸序列的多肽(以從表達用宿主生物中分泌該衍生物)、任選的不超過100氨基酸長的任何期望氨基酸序列和使得可以從該衍生物的羧肽酶B部分酶切除去N端附加肽段的內(nèi)肽酶識別序列。這類內(nèi)肽酶識別序列的實例有胰蛋白酶、Xa因子、彈性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和膠原酶相應(yīng)的已知識別序列。

令人吃驚的是，發(fā)現(xiàn)羧肽酶原B能和胰島素原與胰蛋白酶在單罐反應(yīng)(one-pot?reaction)中反應(yīng)，以致新形成的活性羧肽酶B能立即識別和水解胰島素B鏈羧基末端形成的精氨酸。這種方法得到的羧肽酶B比經(jīng)保存后再加到與胰島素原的反應(yīng)中的羧肽酶B活性更高。反應(yīng)混合物里的胰蛋白酶不僅能活化羧肽酶原B，也特異性切割胰島素原，因而有利于釋放成熟胰島素。