[發明專利]胰羧肽酶原B、其同工型和突變蛋白的制備及應用

有效

• 申請號: 00806080.0
• 申請日: 2000-03-23
• 公開（公告）號: CN1346407A
• 公開（公告）日: 2002-04-24
• 發明（設計）人: P·哈勃曼
• 申請（專利權）人: 阿文蒂斯藥物德國有限公司
• 主分類號: C12N15/57
• 分類號: C12N15/57;C12N9/48;C12N1/19;C07K14/62
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 唐偉杰

1.制備胰羧肽酶B或羧肽酶B的同工型或突變蛋白的方法，其中

(a)在微生物中以分泌形式表達羧肽酶B或羧肽酶B同工型或突變蛋白的天然或非天然前體形式，

(b)純化該以分泌形式表達的前體形式，并

(c)通過酶處理將純化的前體形式轉化成有活性的羧肽酶B或羧肽酶B同工型或突變蛋白。

2.根據權利要求1的方法，其中胰羧肽酶B或其同工型來源于人。

3.根據權利要求1或2的方法，其中天然前體形式相應于羧肽酶原B或羧肽酶原B的同工型。

4.根據權利要求1或2的方法，其中非天然前體形式具有下述結構：

S-(As)_x-E-CB，????(I)其中

S是導致表達過程中形成的該融合蛋白從相應微生物分泌的信號肽；

As是任何期望的遺傳上可編碼的氨基酸；

E是由內肽酶識別序列組成的肽接頭；

CB是羧肽酶B或羧肽酶B同工型或突變蛋白的氨基酸序列；且

X是0-100的整數。

5.根據權利要求1-4之一的方法，其中給所述天然或非天然前體形式連接一個肽序列，該肽序列使得可以通過親和層析純化該前體形式。

6.根據權利要求5的方法，其中連接用于通過親和層析純化的序列是1-6個組氨酸殘基，優選4個組氨酸殘基。

7.根據權利要求1-6之一的方法，其中用于表達的微生物是巴斯德畢赤酵母。

8.根據權利要求1-7之一的方法中，其中使用胰蛋白酶、彈性蛋白酶、Xa因子、胰凝乳蛋白酶或膠原酶，優選胰蛋白酶，用于酶處理。

9.根據權利要求1-8之一的方法，其中步驟(C)在合適的反應條件下、在含有胰島素B、C和A鏈的胰島素前體形式或胰島素衍生物存在時進行，并且在此方法中形成了成熟胰島素或成熟胰島素衍生物，再從反應混合物中分離該成熟胰島素或成熟胰島素衍生物。

10.羧肽酶原B和羧肽酶B或其同工型或突變蛋白在權利要求9的方法中的用途。

11.用于根據權利要求1-9之一的方法的核酸結構，其包含編碼羧肽酶B或羧肽酶B同工型或突變蛋白的天然或非天然前體形式的DNA序列，其中所述編碼序列可操作地與使該前體形式能夠在適合微生物中表達的啟動子相連。

12.根據權利要求11的核酸結構，其中所述DNA序列編碼式I的蛋白質。

13.根據權利要求11或12之一的核酸結構，其中另有編碼1-6個，優選4個組氨酸殘基的DNA序列與編碼羧肽酶B的天然或非天然前體形式的DNA序列相連。

14.制備根據權利要求11-13之一的核酸結構的方法，其中

(a)分離或制備所述DNA序列，并

(b)以適當的方式插入載體中。

15.權利要求11-13之一的核酸結構在權利要求1-9之一的方法中的用途。

16.包含權利要求11-13之一的核酸結構的宿主細胞。

17.制備根據權利要求16的宿主細胞的方法，其中將權利要求1-9之一的核酸結構包括在適合的微生物中。

18.權利要求16的宿主細胞在權利要求1-9之一的方法中的用途。