[發明專利]用于cAMP和腺苷酸環化酶的酶熒光測定方法

無效

• 申請號: 00805191.7
• 申請日: 2000-03-13
• 公開（公告）號: CN1344330A
• 公開（公告）日: 2002-04-10
• 發明（設計）人: 杉山篤
• 申請（專利權）人: 扶桑藥品工業株式會社
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06;C12Q1/34;C12Q1/42;C12Q1/48
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所
• 代理人: 封新琴

發明領域

本發明提供了一種在含有非環腺嘌呤核苷酸的生物樣品中不使用放射性試劑測定cAMP含量或腺苷酸環化酶活性的方法，其中所述的非環腺嘌呤核苷酸選自由內源性腺苷酸環化酶(環腺苷-3′，5′-單磷酸)產生的cAMP、ATP(腺苷三磷酸)、ADP(腺苷二磷酸)及其混合物組成的組。更具體地說，本發明涉及一種包括下列步驟的方法：(1)將生物樣品與有效量的腺苷三磷酸雙磷酸酶、腺苷脫氨酶和堿性磷酸酶合并以便以酶促方式除去所述樣品中非cAMP的非環腺嘌呤核苷酸并除去該樣品中的葡糖-6-磷酸；(2)以酶促方式將cAMP轉化成AMP；(3)不使用放射性試劑測定AMP的量。

腺苷酸環化酶(腺苷酸環化酶、腺苷酸環化酶，EC4.6.1.1)是一種在有Mg²⁺或Mn²⁺存在的情況下催化下列轉化反應的酶：

ATP→cAMP

腺苷酸環化酶局部存在于細胞膜上并且作為大量基礎激素和神經遞質的信號轉導級聯起關鍵作用。

例如，已經使用腺苷酸環化酶活性的測定來研究由移植的人體心臟和在充血性心力衰竭中表現出的改變的生理學特性。參見M.R.Bristow等，New?Engl.J.Med.，307，205(1982)；K.G.Lurie等，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.，86，195(1983)。

可以通過監測經腺苷酸環化酶的催化作用而由ATP合成的cAMP含量的變化來測定腺苷酸環化酶的活性。

然而，對腺苷酸環化酶生物作用的更加清楚的闡述已經受到準確監測cAMP組織水平改變中出現的困難的限制。

發現cAMP(環腺苷-3′，5′-單磷酸)是作為起肝細胞中腎上腺素和胰高血糖素的血糖升高功能的媒介作用的因子。[E.W.Sutherland等，J.Am.Chem.Soc.，79，3608(1957)]。且還發現cAMP介導激素諸如促腎上腺皮質激素(ACTH)、黃體生成素(LH)、酪氨酸刺激激素(TSH)和甲狀旁腺素(PTH)這樣的激素或諸如前列腺素這樣的生理活性物質的作用。因此，當肽激素類或活性胺類已經分泌出來且已經到達靶細胞時，cAMP向其轉移信息以便進行酶促反應，即起第二信使的作用。

cAMP由ATP通過定位在活體膜上的腺苷酸環化酶來合成并通過磷酸二酯酶分解成5’-AMP。cAMP廣泛存在于細菌或動物體內，但cAMP的濃度極低(穩態濃度為0.1-1nmol/g濕重)。作為cAMP的測定方法，便利地采用使用cAMP結合蛋白的測定方法或放射性免疫測定方法。cAMP含量取決于細胞的富營養、增殖、分化、適應性和靈敏度的改變。

各種哺乳動物和非哺乳動物組織和液體中cAMP的測定提供了一種用于評價細胞存活力、內分泌激素軸功能、腺苷酸環化酶活性和磷酸二酯酶活性的有用方式。此外，使用cAMP的測定來評價包括但不限于G族蛋白質(鳥嘌呤核苷酸結合蛋白)在內的大量信號轉導蛋白的活性，所述的信號轉導蛋白在信號轉導、核糖體蛋白的合成、新生蛋白的轉運和其它重要細胞功能中起主要作用。Bourne等，Nature，348，125(1990)。

此外，可以將cAMP的測定用于評價其它可以改變特定細胞、組織、器官或體液中的環核苷酸水平的內源性和外源性化合物(例如一氧化二氮)。

許多激素使用cAMP作為第二信使，它們包括但不限于：腎上腺素、去甲腎上腺素、促腎上腺皮質激素(ACTH)、血管升壓素、胰高血糖素、促甲狀腺素和促黑激素，它們是活生物體內的一些主要的調節激素/蛋白質。可以使用本發明用于cAMP的方法測定組織、血清、體液和所有細胞培養物(細胞和培養基)內所有這些激素和調節物的活性。在激素失衡可導致特殊病理情況的各種疾病狀態中進行這些激素的測定。

一旦激素或調節蛋白與特定受體發生相互作用，則在這種情況中，第二信使cAMP通過生化反應級聯產生。在某些情況中，也可以通過使用cAMP的減少作為部分特異性激素信號轉導途徑的激素來特異性抑制cAMP的產生。這種調節蛋白或激素和受體相互作用的結果可以導致但并不限于下列情況：(1)例如，繼發于離子通道改變的細胞透性的改變；(2)和對cAMP濃度敏感的酶催化反應速率的改變；以及(3)包括其它酶合成和降解在內的蛋白質合成速率的改變。在激素或調節蛋白與受體發生相互作用后可以使用一定量的cAMP來直接或間接監測結果。