[發明專利]用于cAMP和腺苷酸環化酶的酶熒光測定方法

無效

• 申請號: 00805191.7
• 申請日: 2000-03-13
• 公開（公告）號: CN1344330A
• 公開（公告）日: 2002-04-10
• 發明（設計）人: 杉山篤
• 申請（專利權）人: 扶桑藥品工業株式會社
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06;C12Q1/34;C12Q1/42;C12Q1/48
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所
• 代理人: 封新琴

1.一種以更為快捷的方式除去生物樣品中由內源性ATP、ADP和AMP組成的非環腺嘌呤核苷酸以及內源性葡糖-6-磷酸的方法，該方法包括用有效量的腺苷三磷酸雙磷酸酶、堿性磷酸酶和腺苷脫氨酶處理所述樣品以便除去所述的非環腺嘌呤核苷酸和葡糖-6-磷酸的步驟。

2.一種測定生物樣品中cAMP含量或腺苷酸環化酶活性的方法，該方法下列步驟：

清除反應：將生物樣品與有效量的腺苷三磷酸雙磷酸酶、堿性磷酸酶和腺苷脫氨酶合并以便除去由內源性ATP、ADP和AMP組成的非環腺嘌呤核苷酸以及內源性葡糖-6-磷酸；

轉化反應：以酶促方式將所述生物樣品中的cAMP轉化成AMP；和

檢測反應：不使用放射性試劑測定AMP的量。

3.根據權利要求2所述的方法，其中在所述的清除反應中進一步包括將所述生物樣品與有效量的葡糖氧化酶、糖原磷酸化酶和堿性磷酸酶合并以便以酶促方式從所述生物樣品中除去內源性糖原的步驟。

4.根據權利要求2所述的方法，其中通過將所述生物樣品與有效量的磷酸二酯酶合并來進行所述的轉化反應。

5.根據權利要求2所述的方法，其中在轉化成AMP后用螯合劑使用于所述cAMP轉化成AMP的轉化反應中的酶失活。

6.根據權利要求5所述的方法，其中所述的螯合劑是EDTA。

7.根據權利要求2所述的方法，其中所述的檢測反應包括下列步驟：在有加入到所述樣品中的無機磷酸存在的情況下通過使糖原磷酸化酶與糖原接觸而使糖原轉化成葡糖-1-磷酸并在體外用所述AMP激活所述轉化反應。

8.根據權利要求7所述的方法，其中所述的檢測反應進一步包括下列步驟：將所述樣品與有效量的葡糖磷酸變位酶合并以便將葡糖-1-磷酸轉化成葡糖-6-磷酸且然后將所述樣品與有效量的葡糖-6-磷酸脫氫酶合并而將葡糖-6-磷酸轉化成6-磷酸葡糖酸內酯和NADP⁺以便將葡糖-1-磷酸轉化成6-磷酸葡糖酸內酯和NADPH。

9.根據權利要求8所述的方法，其中所述的檢測反應進一步包括下列步驟：在有水存在的情況下加熱所述樣品以便將6-磷酸葡糖酸內酯轉化成6-磷酸葡糖酸且然后將所述樣品與有效量的NADP⁺合并以便將6-磷酸葡糖酸轉化成5-磷酸核酮糖和NADPH。

10.一種測定生物樣品中cAMP含量或腺苷酸環化酶活性的方法，該方法下列步驟：

清除反應：將生物樣品與有效量的腺苷三磷酸雙磷酸酶、堿性磷酸酶和腺苷脫氨酶合并以便以酶促方式除去非cAMP的內源性非環腺嘌呤核苷酸并除去內源性葡糖-6-磷酸；

轉化反應：以酶促方式將所述生物樣品中的cAMP轉化成AMP；和

檢測反應：以酶促方式將ATP轉化成果糖-6-磷酸，然后以酶促方式將果糖-6-磷酸轉化成6-磷酸葡糖酸內酯和NADPH并且不使用放射性試劑來測定NADPH的濃度。

11.根據權利要求10所述的方法，其中在所述的清除反應中進一步包括將所述生物樣品與有效量的葡糖氧化酶、糖原磷酸化酶和堿性磷酸酶合并以便以酶促方式從所述生物樣品中除去內源性糖原的步驟。

12.根據權利要求10或11所述的方法，其中所述的檢測反應包括下列步驟：在以酶促方式將果糖-6-磷酸轉化成6-磷酸葡糖酸內酯和NADPH后，進一步加熱所述反應混合物且然后加入6-磷酸葡糖酸脫氫酶和NADP⁺以便將所述的6-磷酸葡糖酸內酯轉化成5-磷酸核酮糖和NADPH。

13.根據權利要求10所述的方法，其中在所述的清除反應中，非cAMP的內源性非環腺嘌呤核苷酸是ATP、ADP、AMP及其混合物中的一種或多種。

14.根據權利要求10所述的方法，其中在所述的轉化反應中，通過合并有效量的磷酸二酯酶、肌激酶和丙酮酸激酶而將cATP轉化成ATP。

15.根據權利要求10所述的方法，其中在所述的檢測反應中，通過合并己糖激酶和丙酮酸激酶而將ATP轉化成果糖-6-磷酸。