[發明專利]BHV－l基因缺失的病毒疫苗

無效

• 申請號: 00803136.3
• 申請日: 2000-01-18
• 公開（公告）號: CN1364193A
• 公開（公告）日: 2002-08-14
• 發明（設計）人: S·I·喬杜利
• 申請（專利權）人: 堪薩斯州立大學研究基金會
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/38;A61K39/265;C12Q1/70
• 代理公司: 上海專利商標事務所
• 代理人: 徐迅

1.發明領域

本發明主要涉及重組牛皰疹病毒疫苗及其相應的構建方法。具體說，本發明涉及傳染性重組牛皰疹病毒I型(BHV-I)的構建，其缺失天然糖蛋白E(gE)編碼區，在gE基因座上插入了功能性β-半乳糖苷酶基因(β-gal)。天然gE編碼區的缺失使該病毒減毒，且可作為基因型或免疫學標記，可將缺失gE的重組病毒與天然類型的病毒感染區分開。另外，插入β-gal基因提供一種通過宿主細胞中β-gal活性的表達，來檢測是否存在缺失gE的重組病毒感染的表型方法。

2.現有技術的描述

牛皰疹病毒I型(BHV-I)，也稱為傳染性牛鼻氣管炎病毒(IBRV)，與牛的許多臨床疾病相關，包括鼻氣管炎、結膜炎、生殖道感染和偶然性流產、腸炎、腦炎和牛全身系統的感染。BHV-I基因組由約140kb的線性dsDNA分子構成。由側接于內部和反向末端重復序列(分別為I_R和T_R)的單一長(U_L)區域和單一短(U_S)區域構成。BHV-I基因組編碼約70種蛋白質(Misra等人，牛皰疹病毒1的特異性蛋白質(傳染性牛鼻氣管炎，J.Virol.40：367-378(1981)))。與其他幾種動物的皰疹病毒相似，BHV-I基因組編碼糖蛋白(g)gE基因。已報道了兩種不同的菌株BHV-IgE基因序列，其編碼575氨基酸(aa)殘基(Leung-Taek，P.等人，“牛皰疹病毒I型菌株(ST株)短單一區域(U_S)的完整DNA序列和基因組成”，Virology?199：409-421(1994)；Rebordosa，X.等人，“對牛皰疹病毒I型的編碼糖蛋白的基因(與HSV-1的gE基因同源)的作圖、克隆和測序”，Gene，149：203-209(1994))。預計gE氨基酸在N端(推定的信號序列)和C端(跨膜序列)附近含有幾段疏水性氨基酸，其通常是I類膜內在蛋白質。已顯示BHV-IgE和其在其他皰疹病毒中的同類物在體外復制中不是必須的，但假性狂犬病病毒(PRV)基因組整個gE編碼序列的缺失將導致活疫苗菌株Norden和Bartha的毒性減少(Petrovskis，E.A.等人，“假性狂犬病病毒疫苗菌株中的缺失和它們對合成糖蛋白gp63的影響”，J.Virol.60：1166-1169(1986))和神經侵襲性的改變(Card，J.P.等人，“在大鼠目視系統的感染中假性狂犬病病毒包膜糖蛋白gI影響向神經性和毒性”J.Virol.66：3032-3041(1992))。所以，在動物病毒的全致病效力中需要gE基因的表達但在組織培養物的生長中則不需要(Kritas等人，“鼻內接種后在豬三叉神經路徑中假狂犬病病毒(ADV)單一糖蛋白缺失突變體的侵入和蔓延”，Vet.Microbiol.50：323-334(1994)；Kritas等人，“在豬嗅覺神經路徑中假狂犬病病毒的侵入和蔓延中包膜糖蛋白gI、gp63和gIII的作用”，J，General?Virol，75：2319-2327(1994))。

最近，人們產生了將PRV和IBR的缺失gE基因的突變體用作不同標記疫苗的興趣。近期，歐洲正將缺失gE的標記疫苗用于根除IBR。但歐洲的這種gE缺失型疫苗菌株沒有β-gal標記物，這種標記物可以用于檢測β-gal酶活性的原位組織化學方法和檢測β-gal蛋白質的原位組織化學方法和免疫印跡方法。β-gal的編碼區也可作為該重組病毒的基因型標記物。不難用Southern印跡雜交檢測此病毒，也可用PCR測試來確定野生型疫苗病毒的遺傳純度。所以，需要的是一種無毒的gE缺失型IBRV菌株，其含有合適的表型/組織化學/基因型β-gal標記物。

發明概述

已構建了一種BHV-I重組病毒(gEΔ3.1IBRβ)，該病毒中缺失了含有編碼gE基因序列部分的gE開放讀框(ORF′s)，在其位置插入了一嵌合的報道基因/標記基因。這種插入的β-半乳糖苷酶(β-gal)基因在病毒的復制中無調節作用，但可作為gEΔ3.1IBRβ病毒的表型標記物。