[發明專利]采用多種DNA聚合酶的DNA測序方法和所用的試劑盒

無效

• 申請號: 00802714.5
• 申請日: 2000-11-25
• 公開（公告）號: CN1336960A
• 公開（公告）日: 2002-02-20
• 發明（設計）人: 樸韓浯;俞在亨
• 申請（專利權）人: 株式會社百尼爾
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 丁業平,王維玉

技術領域

本發明涉及DNA核苷酸序列分析方法和所用的試劑盒，更具體地，涉及通過對DNA核苷酸序列進行一次分析而比常規方法能更準確地分析DNA全長核苷酸序列的DNA核苷酸序列分析方法和試劑盒。

背景技術

已經知道，桑格雙脫氧核苷酸介導的鏈終止法是用于分析DNA核苷酸序列的常規方法。在桑格法中，DNA核苷酸鏈通過和在戊糖的C-3位含有取代的羥基的脫氧核苷酸(dNTP)反應而延長，并通過和在戊糖的C-3位不含有取代的羥基的雙脫氧核苷酸(ddNTP)反應而終止。

在桑格法中，四種dNTP如脫氧鳥苷三磷酸(dGTP)、脫氧腺苷三磷酸(dATP)、脫氧胸苷三磷酸(dTTP)和脫氧胞苷三磷酸(dCTP)用作產生與模板DNA互補的DNA片段的底物。四種ddNTP如雙脫氧鳥苷三磷酸(ddGTP)、雙脫氧腺苷三磷酸(ddATP)、雙脫氧胸苷三磷酸(ddTTP)和雙脫氧胞苷三磷酸(ddCTP)用作用于終止互補DNA片段的鏈延長反應的底物。與dNTP不同，ddNTP在戊糖的C-3位不含有羥基。因此，當ddNTP和延長反應中的互補DNA片段的末端反應時，互補DNA片段的鏈延長反應被終止。

因此，在桑格法中產生了不同長度的其末端被ddNTP終止的DNA片段。在桑格法中，產生了與模板DNA的核苷酸數目相對應的不同的互補DNA片段，進而通過電泳，按分子量的順序將其進行分離。之后，通過測定每個互補DNA片段的末端堿基來識別模板DNA的核苷酸序列。

然而，盡管桑格法很方便，但是它的一個缺陷在于，由于互補DNA延長反應的持續合成能力是有限的，只有長度在500-700bp的DNA可以被準確測定。例如，為了準確和完整地識別平均長度為2Kb的人類cDNA，DNA測序步驟需要通過對人類cDNA的分割來重復三次以上。如上所解釋的，作為長DNA的測序方法，桑格法是一種費時、費力和昂貴的方法。

同時，在所謂的鳥槍法(已知是用于基因組DNA的大規模核苷酸測序方法)中，全長DNA被分割為幾個DNA片段，分別識別每個片段的堿基的序列。之后，使用計算機相互比較每個片段的序列，通過刪除重疊部分來分析全長DNA序列。在上述鳥槍法中，利用可通過一次DNA序列分析識別的DNA長度的擴展來縮減全長DNA序列分析所需的時間和勞力。

通常，在常規的桑格雙脫氧核苷酸介導的鏈終止方法中，采用單個的DNA聚合酶。因此，對應于模板DNA?20-30bp的短DNA片段和對應于模板DNA?600-700bp的長DNA片段少量生成。然而，對應于模板DNA?40-500bp的DNA片段大量生成。所以，短DNA片段和長DNA片段的含量相對較低，從而DNA兩端末端部分的核苷酸序列比其中間部分難以測定。

由于上述原因，可通過對核苷酸序列的一次分析進行分析的DNA的長度實際上受到限制。因此，人們長期以來為得到一種新方法進行了多種研究，該方法應能擴展通過核苷酸序列的一次分析來識別的DNA長度，所述核苷酸序列的一次分析是借助對模板DNA兩端末端部分更準確的測定進行的。

發明的公開

因此，本發明的目的在于提供一種通過核苷酸序列的一次分析測定較長DNA序列的方法以及該方法所用的試劑盒。本發明的方法是對常規桑格DNA測序方法的改進，它可以用于測定比可由桑格測序方法所測定的更長的DNA。

本發明的目的可以通過提供一種DNA序列分析方法來實現，該方法采用了兩種以上的DNA聚合酶，該聚合酶包括其對ddNTP的親和力高于常規桑格法中所用的DNA聚合酶對ddNTP的親和力的DNA聚合酶，和其對ddNTP的親和力低于常規桑格法中所用的DNA聚合酶對ddNTP的親和力的DNA聚合酶。

更具體地，其對ddNTP的親和力高于桑格法中所用的DNA聚合酶對ddNTP的親和力的DNA聚合酶大量產生相對短的DNA片段，而其對ddNTP的親和力低于桑格法中所用的DNA聚合酶對ddNTP的親和力的DNA聚合酶則大量生成相對長的DNA片段。因此，通過本發明的方法，同時采用對ddNTP的親和力相互不同的多種DNA聚合酶，可以無差別地得到從10bp到大于1,000bp的不同長度的DNA片段。所以，對于那些比可通過常規桑格法分析的DNA片段還長的DNA片段，可以通過本發明的方法進行DNA序列分析。