[發明專利]綠膿毒素基因及其包裝與導向蛋白復合物對癌的靶向基因治療

無效

• 申請號: 00137116.9
• 申請日: 2000-12-28
• 公開（公告）號: CN1361285A
• 公開（公告）日: 2002-07-31
• 發明（設計）人: 盧圣棟;郭蕾;李勇;方華圣;陳偉京;王俊;洪梅;路金芝;張樹政
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院基礎醫學研究所
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/79;C12N15/62;C07K14/195;A61K48/00
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司
• 代理人: 林曉紅

本發明涉及突變改型的編碼綠膿桿菌毒素第III結構域的重組DNA，包含所述重組DNA的表達型重組體，以及由所述的表達型重組體與一種融合蛋白的復合物制備的針對惡性腫瘤特別是細胞表面表皮生長因子(EGF)富集的惡性腫瘤的靶向基因治療藥物。所述的融合蛋白由人組蛋白H1一部分和人表皮生長因子一部分組成，其也是本發明的一個方面。

綠膿桿菌毒素(PE)是由綠膿桿菌分泌的一種毒素，具有三個結構域，結構域Ia(AA1-252)為細胞結合結構域，結構域II(AA253-364)為轉運結構域，結構域III(AA405-613)為ADP糖基化區域，結構域II和結構域III又合稱為PE40，而結構域Ib(AA365-404)無明顯的生物學功能。PE是一種極毒的毒素，僅僅對小鼠一次靜脈注射0.3微克即可使之在24小時內死亡。對于一個細胞來說，幾個分子的毒素的導入即可使這個細胞死亡。由于PE這種獨特的性能，使得其作為一種很有前途的毒素被應用到腫瘤基因治療中去。

惡性腫瘤的傳統治療方法，如手術、放射治療、化學治療以及對于某些類型腫瘤的內分泌治療，很多情況下療效不好，從而基因治療手段逐漸成為惡性腫瘤治療方法中最有前景的一種。靶向性基因治療，又稱“生物導彈”技術，正越來越引起人們的關注。第一代生物導彈的設計思路是將單克隆抗體與藥物、核素或毒素蛋白融合在一起用于臨床治療，其主要問題是靶向性差；第二代生物導彈的設計思路是將不同功能的基因區段拼接所構建的融合蛋白作為“分子導向”型導彈。如人工構建IL2-PE40融合蛋白用于治療某些自身免疫性疾病。其主要問題是人工構建的融合蛋白由于其中的PE40對人體而言是異源蛋白，在人體應用時會有較強的免疫原性，無法實際在臨床上推廣；第三代生物導彈主要設計思路是利用治療基因(或基因片段)與多聚陽離子分子形成DNA-蛋白質復合體，利用此復合體中蛋白質上的特異性配體作為分子識別蛋白，將整個復合體特異性導向到靶細胞實現其靶向性設計。

關于特異性配體的選擇，病理統計結果表明，在癌癥患者中有40-50％的不同種類的腫瘤，即鱗狀上皮癌的癌細胞表面表皮生長因子(EGF)受體過度表達，這一現象甚至成為所患癌癥危害程度的指標之一。體內癌組織出現此現象的患者，經傳統療法治療之后往往預后不良。也許正是與此有關，這一類型的癌癥成為基因治療的首選目標之一。富集于癌細胞表面的EGF受體雖然標志著更高的惡性程度，但在基因治療的研究當中，卻為癌細胞的選擇性殺傷提供了足以利用的標靶。但是使用完整EGF分子作為配體會造成刺激DNA合成與細胞增殖的分子效應出現，從而促進惡性腫瘤在體內增殖。因此改造配體也成為制備這一類型基因治療藥物的關鍵，這也是本發明中所涉及的一個方面。

另外，經常用于結合DNA的多聚陽離子為多聚賴氨酸(polylysine)，但大部分的多聚賴氨酸都是人工合成的，在基因治療臨床應用中成本極高(在美國，固相合成的28aa，1克約為40～50萬美元，在中國，約為150～160萬人民幣)，以致于即使臨床試驗成功，也幾乎無法在臨床推廣應用。為了降低成本，并盡可能減少外源物質引起免疫原性的可能，需要有更廉價易得且無免疫原性的結合DNA的多聚陽離子物質。這一點也是本發明所考慮解決的問題之一。

因此，本發明的一個目的在于提供一種突變改型的編碼綠膿桿菌毒素第III結構域的重組DNA及包含所述DNA的表達型重組體，該重組DNA編碼的突變綠膿桿菌毒素毒性更強。

本發明的另一個目的在于提供一種惡性腫瘤靶向基因治療藥物，其包含所述的表達型重組體與一種融合蛋白的復合物。所述的融合蛋白由人組蛋白H1一部分和人表皮生長因子一部分組成。

本發明的再一目的在于提供一種融合基因，該融合基因編碼用于生產本發明的靶向基因治療藥物中的融合蛋白，所述融合蛋白包括人組蛋白H1的106個氨基酸和人表皮生長因子C環的22個氨基酸，或者所述融合蛋白包括人組蛋白H1的221個氨基酸和人表皮生長因子C環的22個氨基酸。此類融合蛋白是用基因工程技術方法生產的，同固相合成比較，其造價約可降低2～3個數量級，以便于臨床實驗及可能的臨床應用。