[發(fā)明專利]幽門螺桿菌fcagA基因表達(dá)工程菌的構(gòu)建及其產(chǎn)物的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 00135459.0
• 申請日: 2000-12-15
• 公開（公告）號: CN1358860A
• 公開（公告）日: 2002-07-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓鋒產(chǎn);閻小君
• 申請（專利權(quán)）人: 西安高科實(shí)業(yè)股份有限公司基因生命科技分公司
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/63;C12N15/70;A61K39/02;//;C12R101)
• 代理公司: 西安新思維專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 李罡

本發(fā)明是關(guān)于幽門螺桿菌(Hp)細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A基因片段(fcagA)表達(dá)工程菌的構(gòu)建及其產(chǎn)物的制備方法；具體內(nèi)容采用PCR方法獲取fcagA基因，構(gòu)建fcagA基因的溫控表達(dá)工程菌，并選擇合適的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法得到表達(dá)活力高、表達(dá)水平高及純度高的目的蛋白。

幽門螺桿菌細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A(CagA)是細(xì)菌的膜蛋白，具有較高的抗原性；傳統(tǒng)的幽門螺桿菌(Hp)培養(yǎng)方法一般需5-7天，浪費(fèi)時(shí)間，且從菌體中提取該蛋白的工藝煩瑣，回收率低，故采用基因重組技術(shù)制備該蛋白是獲得抗原的重要途徑。

本發(fā)明的目的是提供一種構(gòu)建幽門螺桿菌fcagA基因的表達(dá)工程菌，及其產(chǎn)物的制備方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：

一種幽門螺桿菌fcagA基因表達(dá)工程菌的構(gòu)建，選取幽門螺桿菌的DNA中的fcagA基因，其核苷酸序列如下：

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atttttctaa?attcactctt?ggcgatatgg?aaatgttaga?tgttgagggc?gtcgccgaca

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上述的幽門螺桿菌fcagA基因表達(dá)工程菌的構(gòu)建，其關(guān)鍵之處在于：

1)從幽門螺桿菌中提取總DNA；

2)用PCR方法從基因組DNA中擴(kuò)增fcagA基因；

3)將fcagA基因連接在表達(dá)質(zhì)粒pBV220上；

4)將重組表達(dá)質(zhì)粒fcagA/pBV220轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中，獲得工

??程菌。

上述用PCR方法從基因組DNA中擴(kuò)增fcagA基因，其PCR引物設(shè)計(jì)如下：

cagAp1：5’-tcggaattcatgactaacgaaactattgacc-3’

cagAp2：5’-cagggatccatgtcggcgacgccctcaacat-3’

用于擴(kuò)增cagA基因5′一端854bp的片段。

上述fcagA基因與表達(dá)質(zhì)粒pBV220的連接如下：

1)PCR所采用二個(gè)引物是根據(jù)與表達(dá)質(zhì)粒中EcoRI和BamH?I的酶切點(diǎn)

??相匹配而設(shè)計(jì)的，并在EcoR?I點(diǎn)位后設(shè)置起始密碼；

2)fcagA基因5’-端連在表達(dá)質(zhì)粒EcoR?I位點(diǎn)上，3’-端連在BamH?I

??位點(diǎn)上，從而構(gòu)成重組表達(dá)質(zhì)粒fcagA/pBV220。