[發明專利]重組人甲狀旁腺素基因的合成及表達

有效

• 申請號: 00133573.1
• 申請日: 2000-11-13
• 公開（公告）號: CN1353115A
• 公開（公告）日: 2002-06-12
• 發明（設計）人: 黃秀東;游自立;李樹剛;王立兵
• 申請（專利權）人: 梅伯皋
• 主分類號: C07K14/635
• 分類號: C07K14/635;C12N15/16;C12N15/63;C12N15/79
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明是要利用DNA重組技術生產重組人甲狀旁腺素(簡稱rhPTH)，主要是按照人甲狀旁腺素的自然氨基酸序列，合成該多肽類激素基因，進而將該基因整入不同的表達載體，轉化不同的宿主細胞，篩選出能夠表達重組人甲狀旁腺素的工程菌。

hPTH是人的甲狀旁腺細胞分泌的一種由84個氨基酸殘基組成的多肽類激素，其最重要的功能是調節人體內的鈣離子代謝。在臨床上的主要作用是治療各種骨骼類疾病，如低甲狀旁腺素血癥、骨質疏松癥等。研究表明hPTH分子的不同肽段有不同的作用，已知hPTH的N-端34個氨基酸殘基組成的肽段能使其結合腎細胞膜上的激素受體，進而激活腺苷酸環化酶(Adv.Prot.Chem.，32：323-393，1982)；hPTH的28-48肽段可能通過蛋白激酶C起促有絲分裂作用。因此，hPTH分子將人體內的合成及分解代謝功能有機的統一起來了。正是基于此，人們可以人工合成hPTH的不同肽段或hPTH的類似物來研究其在調節鈣離子代謝中的作用。雖然PTH屬于小分子多肽，分子量僅9,500道爾頓，可采用化學法人工合成，但這種方法的技術要求高、難度大。采用基因工程的方法是比較理想的一種選擇。如，由Allelix(加拿大)、Astra(瑞典)和Chiron(荷蘭)三家制藥公司聯合研究的重組人甲狀旁腺素ALX1-11已于1997年9月進入III期臨床。

hPTH的基因序列最早是由Hendy，GN等確定的(Hendy，GN?etalProc.Natl.Acad.Sci.USA，78：7365-7369，1981)。此后，許多研究小組都試圖利用DNA重組技術使其在酵母菌中表達，但均未獲得成功。研究者在E.coli中進行了一系列的表達工作，如有人表達出N-端增加Met-Gly的hPTH，但是Met-Gly殘基的存在，使所得到的表達產物沒有生物活性(Hogset，A?etalBiochem.Biophys.Res.Commun.166：50-60，1990)，Wingender等將hPTH同半乳糖苷酶進行融合表達成功，但是在切去半乳糖苷酶部分后，hPTH的N-端又多出一個脯氨酸(Pro)(Wingender，E?etal?J.Biol.Chem.246：4367-4373，1989)，這又同天然的PTH不同。Hogset等成功地將hPTH的基因拼接到蛋白A啟動子和一種信號肽的下游，在E.coli中實現了分泌型表達完整的PTH分子，不過表達量只有1mg/L，根本沒有生產意義(Hogset，A?etal?J.Biol.Chem.265：7338-7344，1990)。

隨著DNA合成技術的發展，針對一些小分子蛋白，可很方便地采用人工合成的方法得到其相應的基因，并將其中的密碼子改變成最終表達宿主所偏好密碼子，實現高效表達。例如，本公司采用了酵母喜好的遺傳密碼子人工合成的水蛭素基因，在Pichia酵母中以分泌型表達，產量不低于2.0g/L(中國專利號：00129747.3)。但是，針對hPTH基因，Sung和Rabban等(Sung，WL?etalBiochem.Cell.Biol.64：133-138，1986；Rabban，SA?etal?J.Biol.Chem.263：1307-1313，1988)選用酵母喜好的密碼子合成hPTH基因，在酵母中表達并不成功，而在E.coli中表達，其最終產量也只有200ug/L，這一表達量也沒有實際意義。考慮到天然的各種hPTH在不同表達系統中，或是由于表達量太低，不適合工業化生產；或是對其一級結構有所改變，使之活性喪失。唯有選擇融合表達并利用特定的蛋白酶出除去融合蛋白的另一部分，方能夠獲得很高的表達，我們構建的工程菌表達GST-hPTH融合蛋白占菌體總蛋白的量不低于15％。

最終我們對Pharmacia公司的表達載體pGEX4T-1進行了改造，將谷胱甘肽轉移酶(GST)基因同hPTH基因相連形成融合蛋白，在兩個基因中間插入了腸激酶識別的氨基酸序列DDDDK所對應得DNA序列(圖4)。腸激酶的高度特異性剪切可以確保在不破壞hPTH的情況下除去GST部分；采用蛋白酶缺陷型BL21宿主菌構建工程菌使目的蛋白水解的可能性降到最低限度，且該套表達系統較之pTrx或pTrxFus系統更易于規模化生產。最終在E.coli中獲得了同天然hPTH氨基酸序列完全一樣并有生物活性的重組hPTH(rhPTH)。將我們合成的hPTH基因在甲醇酵母Pichia?pastoris中表達，在搖瓶中的表達量不低于0.2g/L。