[發明專利]用疫苗預防水痘的方法

無效

• 申請號: 00133104.3
• 申請日: 1993-06-03
• 公開（公告）號: CN1307902A
• 公開（公告）日: 2001-08-15
• 發明（設計）人: P·J·普羅沃斯特;D·L·克拉;P·A·弗里曼
• 申請（專利權）人: 麥克公司
• 主分類號: A61K39/25
• 分類號: A61K39/25;C12N7/00
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 譚明勝

本申請是申請日為1993年6月3日，申請號為93106673.5，發明名稱為“制備減毒水痘-帶狀皰疹病毒疫苗的方法”的發明專利申請的分案申請。

水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)引起水痘和帶狀皰疹。水痘是一種發生在無VZV免疫性個體上的高度傳染性疾病。90％以上的人口在生命的頭二十年間受到傳染。該疾病嚴重威脅免疫抑制者和成年人。在許多病例中，VZV潛伏于背根神經節細胞中。VZV從潛伏態重新激活時則出現了帶狀皰疹，這是一種痛苦的慢性病。

通過免疫接種預防水痘是人們期望的目標，預計將實現用活的減毒水痘疫苗進行普遍的兒童免疫接種。現有技術已報道了VZV在各種細胞培養系統中的繁殖以及將活的減毒無細胞VZV用作為疫苗。美國專利3,985,615描述了在豚鼠的初生胚細胞中制備適于用作疫苗的減毒的VZV?Oka株。美國專利4,008,317描述了在WI-38細胞中培養VZV的溫度敏感性交變體以用作為疫苗穩定劑。用于維持活VZV的組合物如SPGA，也是本領域內已知的。

VZV疫苗的商品化生產受到的主要限制是從本領域內已知的細胞培養系統中獲得無細胞VZV的產量。使用本發明的新方法可以將無細胞VZV的產量提高約5-20倍。

因此，本發明是一種高產量地制備活的減毒無細胞VZV疫苗的方法。

通常，本領域已知的單層細胞培養方法產生約80,000至160,000個細胞/cm²[Mann，Dev.Biol.Stand.37，149-152(1977)；Wood和Minor，Biologicals?18，143-146(1990)]。這些單層培養物只能生長到有限的密度，因而阻礙了用單層細胞培養物生產病毒抗原。

過去提高細胞培養物密度的努力已轉向用專門的灌注培養容器將飽和密度提高到約1×10⁶個細胞/cm²[Mann，Dev.Biol.Stand.37，149-152(1977)]。本發明提供了獨特的提高細胞產量的方法，但使用了現存的細胞培養系統。

本發明提供了一種方法，它可以使附著細胞生長至比迄今為止可能達到的密度高得多的密度從而使在用于生產疫苗的細胞單層上培養的病毒達到更高的產量。

本發明涉及用于單層細胞培養的新方法以及在該方法中使用的新組合物。該方法需要使用與基本培養基不同的加富培養基，并在該加富培養基中補充最適濃度的類脂。根據本發明方法，使用含有SRFE-2并補充了約0.02-0.4g/ml大豆類脂的新生長培養基，可使單層細胞培養密度大大提高。由此獲得的提高了密度的單層細胞可用于改進病毒抗原的生產以制備抗病毒疫苗。

當用于制備特定疫苗時，本發明是一種用于生產大批量可用于預防水痘的活的減毒無細胞VZV疫苗的方法，該方法包括：在使VZV產量和穩定性最高的條件下，在細胞培養物中最適地繁殖VZV并收集該病毒。該最佳方法的步驟包括：

a.利用大培養體積或加富培養基，并供應不能代謝的二糖如蔗糖，將選自人二倍體細胞如MRC-5的VZV易感染細胞在單層培養中培養至會合；

b.在盡可能接近會合點時，用實用范圍內盡可能高感染復數的VZV感染細胞感染步驟(a)培養的細胞；

c.將VZV感染培養物在高營養狀態下維持約22-96小時，并在VZV產量達到峰值時收集；

d.在收集VZV感染細胞前，用任選含有溶酶體營養劑如氯化銨或氯喹的生理溶液洗滌VZV感染培養物；

e.將VZV感染細胞收集到最小體積的穩定溶液中，并且或者立即破碎細胞，或者冷凍這些細胞供以后破碎；

f.破碎VZV感染細胞以最適地釋放細胞結合的VZV，并除去細胞碎片，以提供無細胞VZV制備物。

圖1.在添加蔗糖的培養基中VZV?PFU的產量。

圖2.無細胞VZV抗原的產量。

圖3.-20℃或4℃時VZV在SPGA穩定劑中的穩定性。

圖4.用不同的培養基獲得的VZV?PFU產量。

圖5.輸入的細胞結合感染復數對無細胞VZV產量的影響。

本發明涉及在單層培養中培養細胞的方法。本發明的目的在于提高附著培養細胞的密度。通過提供補充了最適濃度的類脂的加富生長培養基達到了上述目的。通過在本發明的新的培養基-類脂組合物中培養本發明的單層培養物，可以大大提高病毒噬斑形成單位(PFU)或病毒抗原的產量。因此，使用本發明的細胞培養方法有益于甲型肝炎病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、風疹、輪狀病毒、麻疹、脊髓灰質炎、流行性腮腺炎和其他病毒的疫苗。