[發明專利]建立ApoAI細胞靶標篩藥系統及篩選升HDL藥的方法

無效

• 申請號: 00125733.1
• 申請日: 2000-10-20
• 公開（公告）號: CN1350061A
• 公開（公告）日: 2002-05-22
• 發明（設計）人: 龔邦強;陸浩鈞
• 申請（專利權）人: 上海醫藥(集團)總公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海新天專利代理有限公司
• 代理人: 王巍

1、一種建立ApoAI細胞靶標篩藥系統的技術分案，其特征在于：I人基因組DNA的提取

1)取抗凝血2ml，用2倍的生理鹽水稀釋混勻，

2)在離心管中加入2ml淋巴細胞分離液，在液面上輕輕加入4ml已稀釋混勻的血液，室溫下離心200g?20分鐘，(注：此時紅細胞沉于管底，白色的淋巴細胞及其它有核細胞分布于上層血漿與下層淋巴細胞分離液的界面)，

3)吸棄上清，小心吸出中間有核細胞層，轉入1.5ml?Eppendorf管中，用生理鹽水洗滌1次，

4)將細胞懸浮于TE緩沖液中，加SDS至終濃度為0.5％，蛋白酶K至終濃度為200μg/ml，50℃水浴3小時，其間振搖2-3次，

5)加入等體積平衡酚混勻，室溫離心，10000g離心5分鐘，

6)小心吸取上清，并轉移至另一Eppendorf管，勿將蛋白層吸出，

7)加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，混勻，離心10000g，5分鐘，

8)轉移上清至另一Eppendorf管中，加入1/10體積乙酸鈉(PH5.2)和2.5倍體積的無水乙醇，混勻，-80℃放置30分鐘，

9)離心12000g，15分鐘，棄上清，加1ml冷75％乙醇輕洗管壁，10000g5分鐘，棄盡上清，37℃靜置干燥10分鐘，

10)用100μlTE(pH8.0)溶解Genomic?DNA；II以人基因組DNA為模板用PCR技術復制獲取Apo?AI?Promoter?DNA序列引物：上游：5’GACTCGAGAGGGGAAGGGGATGAGTG?3’

??下游：5’ATAGATCTCCTGAACCTTGAGCTGGG?3’上下游引物各?????????1μl????濃度為10μmol/L10×PCR反應緩沖液????5μldNTP(2mmol/L)???????5μl????濃度為200μmol/LGenomicDNA模板??????1μl????總量1μg去離子水???????????補至50μl混勻后離心15S，加石蠟油30μl于反應表面，97℃變性10分鐘，冰浴冷卻，加Taq酶(5U/μl)1μl，短暫離心，開始循環：變性：95℃??30s退火：60℃??45s延伸：72℃??90s重復30循環，末次循環后，在72℃再延伸10分鐘；III?Agarose(1％)膠電泳鑒定PCR產物Agarose?DNA快速回收(Gibco?BRL，Concert?Gel?Extraction?System)準備：a.50℃水浴裝置b.預熱TE緩沖液至65-70℃

1)切膠：以潔凈、鋒利刀片切下含DNA片段的Agarose膠，修凈邊緣，

2)稱重：膠濃度小于2％，重量小于400mg者，裝入1.5ml?Eppendorf管中，每10mg膠加入30ml?L1(Gel.Solubilization?Buffer，見Gibco公司操作手冊)，

3)溶解：50℃水浴15分鐘以上，每隔3分鐘混勻一次，溶解后繼續水浴5分鐘，

4)裝柱：取一洗脫柱放入一2ml洗滌管中，把“3”中的混和物倒入洗脫柱中，離心12000g?1分鐘，棄去洗滌管中液體，

5)洗滌(可選)：洗脫柱放回2ml洗滌管中，加500μl?L1，室溫放置1分鐘，離心12000g?1分鐘，棄去洗滌管中液體，

6)洗滌：洗脫柱放回2ml洗滌管中，加700μl?L2(Wash?Buffer，含乙醇，見Gibco公司操作手冊)，室溫放置5分鐘，離心12000g?1分鐘，棄去洗滌管中液體，重復離心1分鐘，棄去洗滌管，

7)DNA回收：把洗脫柱放入一新的1.5mlEppendorf管中，加入50μl預熱的TE緩沖液，室溫放置1分鐘，離心12000g?2分鐘，可得回收DNA；IV目的基因克隆入pGEM-T?Easy?Vectors(Promega公司)在一新的0.5ml?Eppendorf管中先后加入如下試劑：2×Rapid?Ligation?Buffer???5μlpGEM-T?Vector(50ng)????????1μlPCR?product(膠回收產物)????3μlT4?DNA?Ligase(3?U/μl)?????1μl總體積10μl，4℃連接反應過夜；V細菌轉化取JM109感受態菌200μl于Eppendorf管中加入上述已連接了目的基因的T載體(pGEM-T/apo)4μl，輕輕混勻，放置冰上30分鐘，42℃水浴，熱休克90秒，不搖動試管，管中加入無抗生素之LB培養基800μl，37℃溫和搖動(150rpm)45分鐘，5000g離心30秒，吸去上清約800μl，加入X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indoly--D-galactopyranoside)IPTG(isopropyl-β-thiogalactopyranoside)(Promega)混勻后，用無菌涂布器將菌液全部鋪于含氨芐青霉素的瓊脂平板表面，37℃平放20分鐘后倒置培養10-14小時(過夜)，次日挑取白色菌落接種于3ml含氨芐青霉素的液體LB培養基中，37℃搖床搖菌(180rpm)12小時；VI質粒提取取菌液，加入至Eppendorf管中，4℃?4000g離心10分鐘，棄上清，倒置試管，滴盡殘存液體，加入100μl?SI，漩渦振蕩后完全重懸菌體，加入200μl?SII，顛倒Eppendorf管4次，加入150μl?SIII，12000g離心10分鐘，附：①SI：50mm葡萄糖，25mmol?Tris-Hcl(pH8.0)，10mmol

????EDTA(pH8.0)，配制200ml，

②SII：0.2mol?NaOH，1％SDS，配制100ml，

③SIII：5mol乙酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml，雙蒸去離子水28.5ml，將上清移到另一Eppendorf管中，加入等體積(450μl)苯酚氯仿異戊醇，混勻后，12000g離心10分鐘，小心吸取上層水相，加入冰無水乙醇，混勻后-70℃放置30分鐘，12000g離心15分鐘，棄上清，加500μl冷75％乙醇輕洗管壁，10000g?5分鐘，棄盡上清，37℃靜置干燥10分鐘，用50μlTER(PH7.4)(50μlTE?pH8.0，RnaseA?10mg/ml，5μl)溶解質粒；VII酶切鑒定于一新Eppendorf(EP)管中依次加入以下反應物及試劑：ddH₂O???????6μl10×緩沖液????2μl限制酶(Bgl?II及Xho?I)各????1μl質粒DNA??????10μl總體積20μl，離心混合，37℃水浴1-1.5小時，Agarose凝膠電泳，可見大小約380bp的目的基因片段。用前述快速膠回收法回收此片段，克隆目的基因的pGEM-T/apo質粒載體保存于甘油菌中，并送Genecore公司測序，結果與原設計DNA序列一致，結果如下：5’GACTCGAGAGGGGAAGGGGATGAGTGCAGGGAACCCCGACCCCACCCGGGAGACCTGCAAGCCTGCAGACACTCCCCTCCCGCCCCCACTGAACCCTTGACCCCTGCCCTGCAGCCCCCGCAGCTTGCTGTTTGCCCACTCTATTTGCCCAGCCCCAGGGACAGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAGTTCCACATTGCCAGGACCAGTGAGCAGCAACAGGGCCGGGGCTGGGCTTATCAGCCTCCCAGCCCAGACCCTGCCTGCAGACATAAATAGGCCCTGCAAGAGCTGGCTGCTTAGAG⁺¹ACTGCGAGAAGGAGGTGCGTCCTGCTGCCTGCCCCGGTCACTCTGGCTCCCCAGCTCAAGGTTCAGGAGATCTAT??3’VIII抗抗菌素G418的neo基因和目的基因克隆進pGL3-B(pGL3-Basic?DNA?Vector)用于篩選穩定細胞株

1)pGK?neo+質粒以Xho?I酶切可得到約2Kb的含neo的DNA片段，

2)將上述以XhoI酶切得到的neo基因片段克隆入PGL3-B的Sal?I

酶切位點中：

pGL3-B質粒以Sal?I酶切，

PGL3-B?10μl，10×CIP(小牛腸鹼性磷酸酶)Buffer?2μl，CIP

1μl，去離子水補足20μl，37℃水浴30分鐘，

DNA純化：以一次苯酚/氯仿(1∶1)抽提，一次氯仿抽提，乙醇沉淀，晾干，

3)neo片段與經Sal?I酶切后線性化的PGL3-B連接

在0.5ml?Eppendorf管中

目的基因片段0.5μg

載體DNA(pGL3-B)0.1μg

10×連接Buffer?2μl

T₄DNA連接酶1μl

加去離子雙蒸水補至20μl，16℃水浴12-16小時，

4)將重組質粒轉化大腸桿菌。制備含neo抗性基因的pGL3-B質粒(pGL3-B/neo)，

Apo?AI?promoter克隆入pGL3-B/neo質粒：

①將pGL3-B/neo以Xho?I酶切反應(5-10μg?DNA，10-20U酶，

??0.1-0.2μg電泳鑒定)；

②再以Bgl?II作一次酶切反應，

③Agarose電泳并回收酶切片段，

??將雙酶切后的pGL3-B/neo與*處回收得到的ApoAI?promoter

??DNA作連接反應。酶切鑒定并獲得克隆了ApoAI?promoter?DNA的

??pGL3-B/neo(Apo-pGL3-B/neo)，Apo-pGL3-B/neo質粒用于

??轉染人HepG2細胞株(ATCC公司)IX?PGL₃B/Apo-neo質粒轉染人HepG₂細胞株(轉染細胞用Gibco公司的LipofectAmine藥盒)轉基因前試劑準備工作：

1)備好無菌的Eppendorf管(1.5m)，

2)溶液A：將2μg?DNA質粒加入100μl不含有血清和抗菌素的MEM培養基，

3)溶液B：將12μl?lipofectamine加入100μl不含血清和抗生素的MEM培養基，

4)A液和B液小心混合，于室溫擱置40分鐘。混合物可能會形成霧絮狀，這并不妨礙細胞轉染；X轉基因操作步驟：

1)轉染細胞前一天，HepG₂細胞以3×10⁵數進6孔培養板中的每一孔，加入1ml含10％胎牛血清的MEM完全培養液。

2)轉染時，先用2ml?MEM洗HepG₂細胞一次。

3)加0.8ml?MEM培養液入A+B混合液，加以混合，將混合液加入細胞上，此時的混合液不包含胎牛血清，

4)細胞與質粒在培養箱中于5％CO₂和37℃條件下轉染24小時，

5)培養24小時后，將培養液換成正常培養液，即包含1×胎牛血清和抗生素(終濃度：青霉素100u/ml，鏈霉素100μg/ml)的培養液，另培養48小時，形成瞬轉染細胞，

6)將瞬轉細胞以2000細胞/100m平皿的細胞分布密度分孔進培養皿，在含800μg/ml?G418的MEM培養液(培養液成分同于以上第5步)中于37℃，5％CO₂培養箱中培養，進行單克隆細胞株篩選，每二天換液一次，

7)三周后，可見細胞集落形成，用10μl大小的tip挑取單個集落入24孔板擴增培養，

8)待單克隆細胞長滿培養板孔后，一部分細胞繼續傳代培養，一部分細胞測定luciferase表達，luciferase表達達1000/1×10⁵cell以上者則留為后選單克隆，

9)獲得的后選單克隆細胞經10代以上傳代，luciferase報告基因表達無降低者，即為穩定轉染細胞株；XI穩定轉基因細胞株luciferase報告基因測定方法(所有檢測試劑購之于Promega公司)A配制Luciferase測定試劑

將Luciferase?Assay?Substrate凍干粉全部溶于10ml?Luciferase

Assay?Buffer?II，混勻，即可。LAR反復凍融將降低效價，-70

℃可保存一年，故應分裝凍存，

每次反應需100μl，使用前必須置室溫平衡，B配制PBS緩沖液C??配制1×CCLR(Cell?Culture?Lysis?Reagent)

以4倍體積之雙蒸水稀釋5×CCLR即得1×CCLR，使用前必須置室溫平衡，操作步驟：

1)吸去細胞培養液，用PBS?Buffer(1ml)洗2遍，注意不要移動細胞，

2)加入1×CCLR覆蓋細胞，

????????????多孔板??????????????1×PLB

????????????6孔板???????????????500μl

????????????12孔板??????????????250μl

????????????24孔板??????????????100μl

????????????48孔板??????????????65μl

????????????96孔板??????????????20μl

3)充分吹打細胞，將細胞碎片和液體轉入離心管，12,000×g離心5秒，將上清轉入新管中，如時間來不及，需將之保存于-70℃，

4)將20μl細胞抽提液與100μl的Luciferase?Assay?Reagent(室溫平衡)用槍頭混勻，

5)設置Luminometer(型號：Turner?Designs-2010，Turner?DesignsInstrument公司，Sunnyvale，CA)：STD模式，2秒delay，10秒檢測，

6)將管子放入Luminometer中，按Go開始檢測(檢測需在10秒內進行，時間過長，光密度會衰變)。

2、一種應用如權利要求1所述建立的ApoAI細胞株篩選抗動脈粥樣硬化升HDL藥的方法，其特征在于：

1)用穩定轉染細胞株：取1×10⁴細胞接種于48孔培養板中，每孔含0.5ml成分同于瞬轉染細胞培養條件培養24小時；

2)加被篩選物質(不同來源的化合物或混合物)于細胞培養液內和細胞培養24小時；

3)傾去培養液，以PBS緩沖液洗滌細胞二次，待測定。以下測定方法同于轉基因細胞Luciferase報告基因測定法一節；

4)中選化合物的選擇通過與40μg/ml?Gemfibrozil培養后激發的luciferase表達進行比較來達到。被篩化合物其luciferase表達超過Gemfibrozil激發表達一倍以上者則為中選化合物。