[發明專利]以具有催化活性的核酸為基礎的診斷方法

無效

• 申請號: 00122574.X
• 申請日: 2000-06-03
• 公開（公告）號: CN1327070A
• 公開（公告）日: 2001-12-19
• 發明（設計）人: A·V·托德;C·J·菲里;M·J·凱恩斯
• 申請（專利權）人: 莊臣及莊臣研究股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N33/48
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 溫宏艷

在本申請中，引證了各種文獻。這些文獻的內容作為參考文獻編入本申請以更充分地描述本發明涉及的領域的現狀。

本發明涉及診斷特征為已知核酸突變的疾病的方法。本方法采用有催化活性的核酸分子，并用于與諸如癌癥和AIDS的疾病的診斷結合。

各種遺傳和獲得性疾病與諸如點突變，缺失和插入的遺傳改變相關。一些改變直接與疾病的存在相關，而其它改變與疾病風險和/或預后相關。有500種以上的遺傳疾病由單個基因的突變引起(21，22)。它們包括囊性纖維化，肌肉營養障礙，α1-抗胰蛋白酶缺陷，苯丙酮尿癥，鐮狀細胞貧血病或特性，各種其它的血紅蛋白病(21，22)。而且，對一些常見多基因病癥，如動脈粥樣硬化心臟病敏感性增加的個體顯示出與特定DNA序列多態性的遺傳相關。

據認為癌癥是由于涉及細胞增生或分化的基因中遺傳損傷的積累而形成的。ras原癌基因，K-ras，N-ras和H-ras，以及p53腫瘤抑制基因是人癌癥中經常突變的基因的例子。在這些基因中特定的突變導致轉化潛力增加。在評價疾病風險，疾病的診斷，預測病人的預后或對治療的反應的臨床中遺傳分析是無法估價的。然而，引入這類遺傳試驗取決于開發簡單，廉價且迅速的試驗用于遺傳改變。

體外核酸擴增的方法已廣泛應用于遺傳學和疾病的診斷中。在最近10年中，已描述了許多核酸擴增技術。它們包括聚合酶鏈反應(PCR)(1-7)，連接酶鏈反應(LCR)(8)，鏈置換擴增試驗(SDA)(9)和轉錄介導的擴增(TMA)(10，11)(也稱為自我維持的序列復制(SSR))。由PCR，LCR和SDA產生的擴增產物(擴增子)為DNA，而TMA產生RNA復制子?？煞治鲇蛇@些方法或其它方法產生的DNA或RNA模板以確定與疾病相關的序列改變(即突變)的存在。

使用核酸擴增，最近幾年深入研究了催化性核酸。使用催化性核酸作為治療劑抑制基因功能的潛力在文獻中已廣泛討論(12-18)。已表明有催化活性的RNA分子(核酶)能裂解RNA(12)和DNA(17)分子。同樣，也顯示催化性DNA分子(DNAzymes)能裂解RNA(13，19)和DNA(18)分子。催化性核酸僅能裂解靶核酸序列，只要靶序列能滿足最小序列要求。靶序列必須與催化核酸的雜交區互補且靶必須在裂解位點含有特定序列。在裂解位點需要這種序列的例子包括一類DNA?zyme裂解(10-23類型)對嘌呤：嘧啶序列的需要(19)，錘頭核酶對序列尿嘧啶：H的需要，其中H可等于A，C或U，但不能是G(23)。

除了其治療性潛力外，催化性核酸分子也能區分其區別在于單個點突變的靶(14-16)。經過靶向存在于野生型而突變性模板不存在或剛好相反的特異性序列來實現這點。至今，這種區分能力僅被用作基因表達治療性改造的方法。

Nollau-Wagener(24)的綜述就所分析的核酸類型，檢測的突變百分數，進行試驗的時間和花費，涉及使用有毒試劑的問題比較了一些用于點突變檢測的方法。每一種檢查的方法均有其缺點。例如，變性梯度凝膠電泳耗時，RNA酶裂解僅能檢測大約70％可能的突變，化學裂解涉及使用有毒物質。

稱為限制性片段長度多態性(RFLP)的另一方法涉及確定在感興趣的基因座上是否存在限制性酶位點。在極少情況下，可檢測到突變，因為它們碰巧位于天然存在的限制性核酸內切酶識別/裂解位點內(31)。

用于幫助體外擴增的引物內含有錯堿基可能導致引入人工限制性核酸內切酶識別/裂解位點，因此，可用RFLP分析的基因座數目增加(32)。含錯配堿基的修飾引物用于在ras基因家族內關鍵密碼子上引入限制性核酸內切酶的人工識別/裂解位點。在靠近引物3′端設計含有錯配堿基的引物的一般規則已經建立(36)。

盡管使用錯配引物拓寬了RFLP分析的實用性，但該技術仍受這一事實的限制，即限制性酶識別和裂解最少需要4個堿基對。

本發明提供了確定受試者是否患有其特征在于存在已知核酸突變的疾病的方法，該方法包括如下步驟：(a)從受試者中分離核酸分子樣品；(b)(i)擴增分離樣品中存在的核酸片段，該片段已知在患有該疾病的受試者中含有突變，(ii)在合適的條件下，接觸所得的擴增片段與催化性核酸分子，該催化性核酸分子特異性地識別和裂解(1)在具有已知突變的核酸片段中或(2)在相應的野生型核酸片段中，但不是兩者中同時存在的靶序列，前提是步驟(ii)可在步驟(i)之后或同時進行；和(c)，測定步驟(b)(ii)中催化性核酸分子是否裂解擴增片段，以確定受試者是否患有該疾病。