[發明專利]高純度高活性藻藍蛋白的分離純化方法

無效

• 申請號: 00117512.2
• 申請日: 2000-10-02
• 公開（公告）號: CN1291616A
• 公開（公告）日: 2001-04-18
• 發明（設計）人: 錢凱先;李江平;曾文輝;丁鳴
• 申請（專利權）人: 廣東梅縣梅雁藍藻有限公司
• 主分類號: C07K14/405
• 分類號: C07K14/405;C07K1/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種藻藍蛋白的分離方法，尤其是一種從鈍頂螺旋藻(Spiruina?Platensis)中分離純化高純度高活性藻藍蛋白的方法。

中國專利申請號94109295．X公開了一種“鈍頂節旋藻藻藍蛋白及其應用”，其工藝流程為干粉→提取→DEAE52→cellulose→鹽析→透析→SephadexG75→冷凍干燥，獲得作為保健食品的藻藍蛋白，沒有任何純度和活性的要求和指標。

本發明的目的就是提供一種從鈍頂螺旋藻中分離純化獲得高純度高活性藻藍蛋白的方法。

本發明可由如下方式來實現：新鮮的鈍頂螺旋藻藻泥，加入0．001～0．003M，PH=7的磷酸緩沖液(PBS)，凍融1～2次后，置于冰浴中超聲破碎細胞；在4～10℃，以9000～11000轉／秒離心50～70分鐘，棄沉淀；取上清，加入30～60％飽和度硫酸銨在4～10℃，避光靜置過夜，在4～10℃，以13000～18000轉／秒離心20～40分鐘，取沉淀；用0．01～0．03M，PH=7的磷酸緩沖液溶解沉淀，在4～10℃，避光靜置，以0．01～0．03M，PH=7磷酸緩沖液透析，分子截留量12000Da，經快速濃縮后，上SephadexG200層析柱，用0．01～0．03M，PH=7磷酸緩沖液洗脫，收集峰值組分，上DEAE-SephadexA25柱，用0．005～0．007M，PH=7的磷酸緩沖液和0．2～0．4M，PH=7的氯化鈉洗脫，收集峰值組分，上SephadexG200柱，用0．01～0．03M，PH=7的磷酸緩沖液洗脫，整個柱層析在8～10℃，避光條件下進行；取純化的藻藍蛋白樣品檢測A620nm／A280nm值，紫外可見光譜圖、熒光光譜圖以及PAGE電泳(呈顯單一藍色電泳條帶，無其它雜蛋白)；藻藍蛋白立即冰凍干燥，所得干粉在4～10℃避光保存。

本發明簡化了分離純化程序，易于操作，所獲藻藍蛋白的純度和活性高，且成本較低，可作為一種熒光標記物用于免疫化學分析，可以做到雙色或三色標記，具有臨床應用前景，如癌細胞的早期診斷。

下面結合實施例，對本發明作進一步的描述。

實施例一

采收新鮮的鈍頂螺旋藻藻泥100克，避免螺旋藻采收時在自然溫度下發生變質或損傷，加入0．001M，PH=7的磷酸緩沖液，凍(-20℃)融(18℃，避光)2次，置于冰浴中超聲破碎細胞；在5℃，以10000轉／秒離心60分鐘，棄沉淀；取上清，加入60％飽和度硫酸銨在4℃，避光靜置過夜，在4℃，以15000轉／秒離心30分鐘，取沉淀；用0．02M，PH=7的磷酸緩沖液溶解沉淀，在8℃，避光靜置，以0．01M，PH=7磷酸緩沖液透析，分子截留量12000Da；經快速濃縮后，上SephadexG200層析柱，用0．01M，PH=7磷酸緩沖液洗脫，收集峰值組分，上DEAE-SephadexA25柱，用0．005M，PH=7的磷酸緩沖液和0．2M，PH=7的氯化鈉洗脫，收集峰值組分SephadexG200，用0．01M，PH=7的磷酸緩沖液洗脫，整個柱層析在8℃、避光條件下進行，所得藻藍蛋白立即冰凍干燥，所得干粉在4℃避光保存。

藻藍蛋白產品檢測主要儀器有：紫外可見掃描光譜儀、紫外可見分光光度儀、熒光掃描光譜儀、電泳儀等，藻藍蛋白的主要參數和性狀：

(1)純化產物呈純天藍色，具有紅色熒光；

(2)純度比值(A620nm／A280nm)≥4；

(3)紫外可見光譜在620nm處呈現主峰；

(4)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)呈顯單一藍色電泳條帶；

(5)熒光激發峰分別位于590nm和635nm，熒光發射峰位于650nm，均呈顯主峰圖譜。

本發明制備的高純度高活性藻藍蛋白能專一與DNA結合，在流式細胞儀檢測系統中能夠清晰和靈敏地顯示出人體子宮頸癌細胞等超長膨大的異倍體核基因組，從而準確快速地進行癌細胞的診斷，具有臨床應用前景。