[發明專利]一種在玻片上檢測基因突變的方法

無效

• 申請號: 00116095.8
• 申請日: 2000-10-25
• 公開（公告）號: CN1293255A
• 公開（公告）日: 2001-05-02
• 發明（設計）人: 張先恩;文繼開;鄧教宇;劉虹;張治平
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢病毒研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中國科學院武漢專利事務所
• 代理人: 王敏鋒

本發明涉及固相DNA序列突變檢測，更具體涉及一種檢測耐藥性結核桿菌中耐藥性相關基因點突變的方法。

目前應用于玻片中檢測點突變的方法常見的有芯片微測序和高密度寡核苷酸測序芯片。芯片微測序方法是利用熒光素標記的雙脫氧核苷酸進行固相引物延伸，測定基因突變熱點區的序列，可以準確地定位突變。但本方法需要合成大量引物，導致成本高而且所測的序列非常有限，一般難以超過100個堿基。以高密度寡核苷酸測序芯片來檢測基因點突變是在芯片上原位合成4倍于待測基因堿基數的8(或9)聚體寡核苷酸，以熒光標記的待測基因為模板進行芯片雜交，在與野生型基因的雜交信號進行比較后確定突變。寡核苷酸測序芯片檢測突變的準確性無法達到100％，需要原位合成大量的寡核苷酸片段，雜交模板必須標記熒光素，并且芯片密度高，雜交信號的收集與數據的分析處理難度大，因此從開始芯片的制作到最后信息的處理必需成套設備和相應的軟件，成本昂貴。芯片毛細管電泳是利用DNA雙鏈分子形態變化會導致電泳遷移的改變，通過靈敏度高的毛細管電泳可以將突變的DNA雙鏈區分開來。但是該方法對儀器要求很高，許多實驗室尚無能力使用該方法，應用就顯得更為困難。

本發明的目的是提供了一種在玻片上檢測基因突變的方法，將化學法和酶學切割方法結合起來，以酶學檢測或熒光檢測手段準確，簡便易行地檢測固定在玻片上的DNA序列的點突變。

為了達到上述目的，本發明采用以下技術措施：固相載體上的DNA序列的突變的檢測方法是將雜交所得異源雙鏈DNA固定在載體上，然后利用化學試劑對雙鏈DNA和單鏈DNA具不同的化學活性，即化學試劑能夠特異的修飾未配對和錯配的嘧啶類堿基：羥胺鹽酸修飾錯配堿基中的胞嘧啶，高錳酸鉀和氯化四乙胺混合液或四氧化鋨溶液修飾錯配堿基中的胸腺嘧啶。派啶能夠特異的識別被修飾的嘧啶類堿基并在該堿基3′端的磷酯鍵上進行切割造成一個切口，由于切口的一側存在錯配堿基，因此并非嚴格意義上的切口而更類似于一個缺口。用S1核酸酶在一定的溫度和離子濃度下可以將切口所對應的單鏈部分切開。由于產生完全切割，引入的熒光或生物素標記分子可能被完全洗脫。通過熒光或酶學手段檢測標記分子的信號就可以判斷待檢的DNA序列是否存在點突變。

在玻片上檢測結核桿菌耐藥性相關基因點突變的方法是將確定好的結核桿菌標準株(H37Rv)中耐藥性相關基因的一條DNA鏈用巰基衍生物固定在玻片上，然后與突變株中獲得的5′端連有熒光或生物素標記分子的相對應的耐藥性相關基因進行雜交，其特征在于將雜交生成的完整的異源DNA雙鏈固定在玻片或其他固相載體上，異源DNA雙鏈中一條鏈的5′端與巰基硅烷化的玻片或表面連有鏈霉親和素的固相載體相交聯，另一條鏈的5′端攜帶生物素或熒光標記分子；用羥胺溶液修飾錯配堿基中的胞嘧啶，用高錳酸鉀和氯化四乙胺混合液或四氧化鋨溶液修飾錯配堿基中的胸腺嘧啶，用哌啶剪切點突變中的被修飾嘧啶類堿基，加入2到5個單位的S1核酸酶消化處理異源DNA雙鏈中出現的單鏈部分；酶學或熒光檢測連入的標記，確定是否存在突變。

本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果，本發明不僅能夠在玻片上準確并靈敏快速的檢測結核桿菌耐藥性相關基因中存在的點突變，而且還能夠檢測插入、缺失等其他突變，并且檢測DNA序列長度范圍大，成本低廉，操作簡便，適合于玻片和經共價修飾的固相載體上的突變檢測。

實施例：

采用羥胺和高錳酸鉀或四氧化鋨分別修飾固定在玻片上的異源雙鏈DNA堿基錯配中的胞嘧啶或胸腺嘧啶，再用哌啶切割異源雙鏈DNA中被修飾的堿基，然后利用S1核酸酶將異源雙鏈DNA徹底打斷。通過檢測標記信號的有無來表明該異源雙鏈DNA是否存在單堿基的錯配，確定該段基因或DNA序列是否存在點突變。在玻片上檢測結核桿菌耐藥性相關基因上突變的具體步驟如下：

1、熒光素或生物素標記待檢測的基因序列：將6′端帶有巰基的兩種引物分別擴增結核桿菌標準菌株中的基因片段；用5′端帶有生物素標記或帶有熒光的引物壙增耐藥性菌株的相關基因片段。由于兩對引物序列完全一致，擴增的兩段基因片段除了點突變位點外順序完全一致。用柱式PCR產物純化試劑盒純化PCR產物。

2、異源DNA雙鏈的獲得：純化所得兩種PCR產物在退火緩沖液中95℃變性5分鐘，緩慢退火至25℃，無水乙醇沉降并回收退火所得的雙鏈DNA。