[發(fā)明專利]一種在玻片上檢測基因突變的方法無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 00116095.8 | 申請日： | 2000-10-25 |
| 公開（公告）號： | CN1293255A | 公開（公告）日： | 2001-05-02 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 張先恩;文繼開;鄧教宇;劉虹;張治平 | 申請（專利權(quán)）人： | 中國科學(xué)院武漢病毒研究所 |
| 主分類號： | C12Q1/68 | 分類號： | C12Q1/68 |
| 代理公司： | 中國科學(xué)院武漢專利事務(wù)所 | 代理人： | 王敏鋒 |
| 地址： | 430071*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 玻片上 檢測 基因突變 方法 | ||
1、一種在玻片上檢測基因點突變的方法，包括下列步驟：
A、生物素標(biāo)記檢測的基因序列，將5′端帶有巰基的引物分別擴增結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株中的基因片段，用5′端帶有生物素標(biāo)記的引物擴增突變型耐藥性菌株的基因片段；
B、異源DNA雙鏈的獲得，將純化所得兩種PCR產(chǎn)物在退火緩沖液中95℃變性，退火至25℃，無水乙醇沉降并回收；
C、異源DNA雙鏈在玻片上的固定，將純化的雙鏈DNA固定在經(jīng)過硅烷化的玻片上，加入1-2μl的大腸桿菌堿性磷酸酶使其結(jié)合在異源DNA雙鏈上，加入3-5μl的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸和硝基四氮唑藍(lán)混合液，37℃反應(yīng)30-60分鐘；
D、羥胺鹽酸對固定的異源DNA雙鏈中錯配的嘧啶堿基的修飾，在固定異源DNA雙鏈的玻片上加入20μl的2-4mM羥胺鹽酸鹽溶液PH6．0，37℃保溫2小時，用終止緩沖液終止反應(yīng)，用雙蒸水清洗玻片，風(fēng)干；
E、高錳酸鉀、氯化四乙胺混合液對異源DNA雙鏈錯配的嘧啶堿基修飾，在羥胺鹽酸處理過的玻片上加入20μl的1-3mM高錳酸鉀，20-30mM氯化四乙胺混合溶液，25℃保溫1小時，用雙蒸水清洗玻片，風(fēng)干；
F、用哌啶和S1核酸酶切割異源DNA雙鏈，在風(fēng)干的玻片上加入20-50μl，1-2M哌啶，90℃保溫，用雙蒸水清洗，風(fēng)干，加入20μl含有2-5個單位的S1核酸酶，23℃保溫；
G、信號標(biāo)記檢測，清洗玻片，加入1-2μl的大腸桿菌堿性磷酸酶和3-5μl的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸和硝基四氮唑藍(lán)底物混合液，37℃反應(yīng)30-60分鐘。
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