[發(fā)明專利]新的血管生長素衍生蛋白及其編碼序列

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• 申請?zhí)枺?/td>: 00115679.9
• 申請日: 2000-05-15
• 公開（公告）號: CN1277208A
• 公開（公告）日: 2000-12-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 毛裕民;謝毅;黃盛東
• 申請（專利權(quán)）人: 上海博容基因開發(fā)有限公司
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07H21/00;C12N15/10;C12N15/11;C12N15/63;C12N15/64;C12P21/00;A61K38/17;A61P9/00
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 徐迅

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種新的血管生長素衍生蛋白，這種新的血管生長素衍生蛋白具有Asp116His突變。本發(fā)明還公開了一種新的化學(xué)合成的、用細(xì)菌偏愛密碼子編碼的血管生長素衍生蛋白的基因序列和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種多肽的方法。

1985年，美國學(xué)者Fett?JW等從體外培養(yǎng)的人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系HT-29中提取獲得一種具有很強的促血管生長活性的蛋白質(zhì)，分子量約14.1kD，命名為血管生長素(angiogenin，簡稱為“ANG”)。

現(xiàn)已明確，ANG是由123個氨基酸殘基組成的單鏈蛋白分子，具有強烈促血管生長活性，等電點大于9.5，屬于核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)超家族。除了促血管生長活性，ANG還具有特異性水解核糖核酸(ribonuclic?acid，RNA)等多種生物活性。研究表明，ANG主要的作用是促進機體小血管生長，在已知的促血管生長因子中，ANG的促血管生長活性強于大多數(shù)其他因子。在雞胚絨毛尿囊膜血管生長(CAM)試驗中，35?fmol的ANG即可引起典型的輪輻樣血管生長圖案，而3.5pmol的ANG即可使兔角膜出現(xiàn)新生血管。人們因而推論，阻斷或利用其促血管生長作用可能為遏止實體腫瘤的生長或治療各種缺血性疾病提供新途徑。因此，ANG受到眾多研究者的廣泛關(guān)注，與其相關(guān)的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究大量開展，并已逐步闡明ANG及其衍生物的結(jié)構(gòu)、功能特點、作用機制等基本問題，同時展示了良好的應(yīng)用前景。

長期以來，ANG受體及其作用機制等一直是制約ANG研究深入的難題，在很大程度上遲滯了其應(yīng)用研究的進展。近兩年來，這些問題已逐步被認(rèn)識。大量研究證明，肌動蛋白作為ANG受體之一，與ANG能高親和性地結(jié)合，介導(dǎo)著血管生長過程中的許多重要作用。

近來，在人內(nèi)皮細(xì)胞表面又發(fā)現(xiàn)了一種分子量170kD的ANG受體。該受體僅在內(nèi)皮細(xì)胞分布稀疏、不連續(xù)的情況下表達(dá)并與ANG特異性地結(jié)合，引發(fā)與劑量相關(guān)的DNA合成和細(xì)胞增殖反應(yīng)。雖然目前對該受體的研究資料尚少，但其介導(dǎo)的細(xì)胞增殖反應(yīng)已引起許多學(xué)者的興趣，并推測它在ANG的促血管生長過程中起著關(guān)鍵性的作用。ANG與其受體結(jié)合后，可通過兩種途徑進一步作用：第二信使介導(dǎo)的信息傳導(dǎo)以及受體介導(dǎo)的胞飲內(nèi)吞和向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運。

鑒于血管生長素的上述特點，如果能大量表達(dá)血管生長素蛋白，將對有關(guān)疾病的診斷和治療起到積極的推動作用。然而，人體正常組織中血管生長素含量較低，提純難度極大，成本很高，無法用于規(guī)模化生產(chǎn)。而從腫瘤組織中提取則存在較大的風(fēng)險。因此，國外開展了大量的血管生長素基因工程方面的研究工作。結(jié)果表明，大腸桿菌原核表達(dá)ANG蛋白含量較高，占總蛋白含量的5-10％；真核表達(dá)成本較高，得率極低。且原核表達(dá)所得的ANG蛋白與真核表達(dá)的蛋白在促進血管生長方面的活性基本一致。

然而，即使是5-10％的表達(dá)量，對于規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)來說仍是不理想的。因此，本領(lǐng)域迫切需要活性更高的血管生長素衍生蛋白。此外，本發(fā)明還迫切需要能夠高表達(dá)地生產(chǎn)血管生長素衍生蛋白的方法。

本發(fā)明的目的是提供一種新的血管生長素衍生蛋白，它具有高于天然血管生長素的促血管生長的活性。

本發(fā)明的另一目的是提供編碼這種血管生長素衍生蛋白的多核苷酸。

本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的血管生長素衍生蛋白，與天然的血管生長素相比，它包含Asp116His突變。較佳地，該蛋白是具有SEQ?ID?NO：2氨基酸序列的多肽。

在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，該多核苷酸編碼具有SEQID?NO：2所示氨基酸序列的多肽。較佳地，該多核苷酸具有SEQ?ID?NO：1所示的序列。

在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。

在本發(fā)明的第四方面，提供了一種血管生長素衍生蛋白的制備方法，該方法包含：

(a)在適合表達(dá)血管生長素衍生蛋白的條件下，培養(yǎng)上述的宿主細(xì)胞；

(b)從培養(yǎng)物中分離出血管生長素衍生蛋白。

在本發(fā)明的第五方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的權(quán)利要求1所述的血管生長素衍生蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。較佳地，該蛋白是具有SEQ?ID?NO：2氨基酸序列的多肽。

本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。