[發明專利]增效蛋白在原核生物中的表達及其應用

無效

• 申請號: 00114664.5
• 申請日: 2000-06-30
• 公開（公告）號: CN1331286A
• 公開（公告）日: 2002-01-16
• 發明（設計）人: 孟小林;徐進平
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/33;C07K14/005;A01N63/00;//;C12R119)
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本發明涉及在原核生物中表達粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白C末端截短蛋白，含有粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白C末端截短蛋白基因的質粒，用這種重組質粒在原核生物中產生粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白C末端截短蛋白的方法，以及表達的昆蟲病毒增效蛋白C末端截短蛋白在農林業中的應用。

現在已知，昆蟲病毒增效蛋白(enhancin)是由昆蟲病毒基因編碼能顯著提高病毒殺蟲活性的一種功能性蛋白質。1998年，美國學者(Zhong，J.and?R.R.Grandos1998.VIIth?International?Colloguium?on?Invertebrate?Pathology?and?Microbial?ControlIVth?Internatiol?Conference?on?Bacillus?thuringensis.Ausgust?23-28：65)已將粉紋夜蛾顆粒體病毒(Trichoplusia?ni?granulosis?virus簡稱TnGV)增效蛋白基因克隆于核型多角體病毒AcNPV，構建了重組病毒工程毒株，并用該毒株與野生型病毒混合使用，可顯著提高Tn的殺蟲效果。然而，這種工程病毒受到其宿主范圍及其毒力的影響，因此在應用上有著局限。

本發明的目的是提供一種新型的含有粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白C末端截短蛋白基因的工程菌株，該菌株的構建方法、用途以及用該茵株生產增效蛋白的方法。

為實現上述目的，本發明所采取的技術方案如下：

一種工程菌株，E.coli?M15(pQE-TnGVEnNp85)，該菌株含有攜帶粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白C末端截短蛋白基因的重組質粒pQE-TnGVEnNp85，這種菌種命名為E.coli?M15(pQE-TnGVEnNp85)，已于2000年5月17日保藏于湖北省武漢市武漢大學的中國典型培養物保藏中心，登記入冊號為CCTCC?M200010，所含重組質粒pQE-TnGVEnNp85由下列DNA元件組成：

(1)粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白C末端截短蛋白基因；

(2)大腸桿菌質粒復制起始點；

(3)氨芐青霉素抗性基因；卡那霉素抗性基因；

(4)六個連續組氨酸編碼區；

本發明用于構造工程菌株的原始材料有如下幾種：

(1)粉紋夜蛾顆粒體病毒(TnGV)，由美國湯姆·杰弗遜大學贈送。

(2)受體大腸桿菌E.coli?M15菌株，購自QIA-GEN公司。

(3)pQE載體，購自Promega公司。

用來表達顆粒體病毒增效蛋白的重組質粒通過基因工程方法獲得，其構建方法是：

采用堿裂解酚提取法提取TnGV?DNA，并經HindIII消化用作模板，設計引物為：P₁?5’GAC?TCT?GCA?GTA?CAA?AGT?GAT?3’，P₂?5’CGT?GAA?GCT?TAA?CTC?GTTTTC?3’，由上海生工公司合成。

反應條件：模板DNA煮沸3min，迅速冷卻至0℃；反應混合物94℃變性60S，50退火120S，73℃延伸180S，循環30次；終循環于73℃延伸7min。

用Pst?I/HindIII雙酶切消化，得到截短的約2.1Kb片段，與pQE質粒上用相同酶消化的切口，用T4?DNA連接酶連接，構建pQE-TnGVNp85表達質粒，將其轉化至大腸桿菌E.coli?M15菌株，經篩選得到含TnGVC末端截短基因的工程菌株。該工程菌株定名為E.coli?M15?pQE-TnGVNp85，已保藏于中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，登記號為CCTCC?M200010。

將重組獲得的攜帶粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白C末端截短蛋白的工程菌株CCTCC?M200010單菌落挑到內含100μg/ml的Amp(氨芐青霉素)和25μg/ml?Kan(卡那霉素)的LB培養基中(25ml)，37℃，200rpm/min過夜培養，以1∶20比例接種到含上述雙抗500ml?LB培養基中繼續培養，當其濃度達到OD₆₀₀＝0.7-0.9時，加入IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)到終濃度1mM，于37℃，200rpm誘導表達5hr，收獲菌液，4000rpm離心10min，收集菌體沉淀，再按常規方法即可獲得TnGV病毒增效蛋白C末端截短蛋白。

利用攜帶粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白C末端截短蛋白基因的大腸桿菌發酵生產的增效蛋白可作為有效成份提高病毒殺蟲劑，BT殺蟲劑，阿維菌素等生物殺蟲劑的殺蟲效果或單獨以乳劑方式用于轉基因抗蟲棉。