[發明專利]增效蛋白在原核生物中的表達及其應用

無效

• 申請號: 00114664.5
• 申請日: 2000-06-30
• 公開（公告）號: CN1331286A
• 公開（公告）日: 2002-01-16
• 發明（設計）人: 孟小林;徐進平
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/33;C07K14/005;A01N63/00;//;C12R119)
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1.一種工程菌株E.ColiM15(pQE-TnGVNp85)，該工程菌株已提交到中國典型培養物保藏中心保藏，其保藏編號為：CCTCC?M200010。

2.根據權利要求1所述的工程菌株，其特征在于：這種菌株含粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白C末端截短蛋白基因，并能在原核生物細胞中復制。

3.根據權利要求1所述的工程菌株，其特征在于它所含的重組表達載體是由下列DNA元件構成：

(1).粉紋夜蛾昆蟲病毒增效蛋白C末端截短蛋白基因；

(2).大腸桿菌質粒復制起始點；

(3).氨芐青霉素抗性基因；

(4)六個連續組氨酸編碼區。

4.一種構建權利要求1-3所述的工程菌株的方法，其特征在于：以TnGV基因組DNA作模板，設計引物：

P₁?5’GAC?TCT?GCA?GTA?CAA?AGT?GAT?3’

P₂?5’CGT?GAA?GCT?TAA?CTC?GTT?TTC?3’，

用Pst?I/HindIII雙酶切消化，得到截短的～2.1Kb片段，與pQE質粒上用相同酶消化的切口連接，構建pQE-TnGVNp85表達質粒，將其轉化至大腸桿菌E.coliM15菌株，經篩選得到含粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白C末端截短蛋白基因的工程菌株。

5.一種用權利要求1-3所述的工程菌株生產粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白的方法，其特征在于：

將重組獲得的攜帶粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白C末端截短蛋白的工程菌株CCTCC?M200010單菌落挑到內含100μg/ml的氨芐青霉素和25μg/ml卡那霉素的LB培養基中，37℃，200rpm/min過夜培養，以1∶20比例接種到含上述雙抗500mlLB培養基中繼續培養，當其濃度達到OD₆₀₀＝0.7-0.9時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷至終濃度1mM，于37℃，200rpm誘導表達5hr，收獲菌液，4000rpm離心10min，收集菌體沉淀，再按常規方法即可獲得昆蟲病毒增效蛋白質C末端截短蛋白。

6.權利要求1-3所述的工程菌株與昆蟲病毒、蘇蕓金芽胞桿菌、阿維菌素或其它生物殺蟲劑制備成復合生物殺蟲劑在農林業用于病蟲的生物防治，或單獨使用增效工程蛋白用于轉基因抗蟲棉防治棉鈴蟲。